重组克隆的筛选和鉴定讲义(171页PPT).pptx

第七章第七章 重组克隆的筛选和鉴定重组克隆的筛选和鉴定n内容提要内容提要n第一节第一节 载体表型选择法载体表型选择法n第二节第二节 DNA电泳检测法电泳检测法n第三节第三节 核酸杂交检测法核酸杂交检测法n第四节第四节 免疫化学检测法免疫化学检测法n第五节第五节 转译筛选法转译筛选法n第六节第六节 真核重组基因的选择方法真核重组基因的选择方法一般克隆与筛选策略一般克隆与筛选策略第一节第一节 载体表型选择法载体表型选择法n根据载体提供的表型进行选择的方法：根据载体提供的表型进行选择的方法：n抗生素抗性基因的插入失活选择法抗生素抗性基因的插入失活选择法n-半乳糖苷酶的显色反应选择法半乳糖苷酶的显色反应选择法一般原理一般原理n一种利用一种利用抗生素抗性基因抗生素抗性基因或或其他基因其他基因的的插入失活，来筛选重组子的方法插入失活，来筛选重组子的方法n通常外源通常外源DNA插入的位点设计在特定基插入的位点设计在特定基因上，一旦外源因上，一旦外源DNA插入，该基因就被插入，该基因就被破坏而失去活性由此来判断载体上是破坏而失去活性由此来判断载体上是否带有外源否带有外源DNA一、插入失活法的原理一、插入失活法的原理二、利用抗生素抗性基因：二、利用抗生素抗性基因：pBR322n以以pBR322为例，说明利用抗生素抗性基因的插为例，说明利用抗生素抗性基因的插入失活的原理。

入失活的原理1.原理原理n在在pBR322上有多个单一的限制酶位点，如上有多个单一的限制酶位点，如BamH I位点，恰好在一个四环素抗性基因内如果有外源位点，恰好在一个四环素抗性基因内如果有外源DNA插入插入BamH I位点，那么涉及四环素抗性的基位点，那么涉及四环素抗性的基因就损坏，因此，带有重组因就损坏，因此，带有重组pBR322质粒的细胞，质粒的细胞，仍对氨苄青霉素有抗性，但对四环素的抗性消失仍对氨苄青霉素有抗性，但对四环素的抗性消失（敏感）2.筛选的方法筛选的方法n转化细胞涂布于含有氨苄青霉素的固体培养基上，转化细胞涂布于含有氨苄青霉素的固体培养基上，并培养至菌落出现并培养至菌落出现n用一个牙签接触培养基的表面，将沾有不同菌落用一个牙签接触培养基的表面，将沾有不同菌落的牙签，放到另一含有四环素的固体培养基表面接的牙签，放到另一含有四环素的固体培养基表面接触一下n适温培养，有的克隆生长，有的不生长适温培养，有的克隆生长，有的不生长n根据不会生长的位置，再回到带氨苄的培养基上去根据不会生长的位置，再回到带氨苄的培养基上去找那些原始的克隆找那些原始的克隆n这些克隆因为丧失了对四环素的抗性，就是含有重这些克隆因为丧失了对四环素的抗性，就是含有重组组pBR322质粒的重组子。

质粒的重组子图图 pBR322的结构图的结构图3.抗菌素标记的选择抗菌素标记的选择（1）Ampr 氨苄青霉素抗性基因氨苄青霉素抗性基因n产生产生-内酰胺酶酶使氨苄青霉素变为青霉酮酸内酰胺酶酶使氨苄青霉素变为青霉酮酸青霉酮酸使蓝灰色的青霉酮酸使蓝灰色的碘碘-青霉素指示液青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）褪色褪色nAmpr有有Pst I、Sca I等多个插入位点等多个插入位点2）四环素）四环素n抑制细菌生长，但不杀死细菌抑制细菌生长，但不杀死细菌3）环丝氨酸）环丝氨酸n杀死生长的细菌，但不杀停止生长的细菌杀死生长的细菌，但不杀停止生长的细菌4.选择的过程选择的过程（1）四环素抗性插入失活）四环素抗性插入失活n如果在如果在Tetr上上插入外源插入外源DNA，导致四环，导致四环素抗性基因失活，可用素抗性基因失活，可用四环素四环素 环丝氨环丝氨酸酸的平板，选择重组克隆的平板，选择重组克隆nTetr插入失活的细菌，其生长可被四环插入失活的细菌，其生长可被四环素素抑制抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；，不被环丝氨酸杀死，保留下来；nTetr不失活的细菌，能抗四环素，正常不失活的细菌，能抗四环素，正常生长，但可被环丝氨酸杀死。

生长，但可被环丝氨酸杀死无环丝氨酸无环丝氨酸图图 四环素抗性插入失活四环素抗性插入失活重组克隆重组克隆（2）氨苄青霉素抗性插入失活）氨苄青霉素抗性插入失活n氨苄青霉素抗性基因编码产生氨苄青霉素抗性基因编码产生-内酰胺内酰胺酶酶使氨苄青霉素变为青霉酮酸酶使氨苄青霉素变为青霉酮酸青霉酮酸使霉酮酸使蓝灰色蓝灰色的碘的碘-青霉素指示液青霉素指示液褪褪色色n如果如果Ampr上插入外源上插入外源DNA，导致氨苄导致氨苄青霉素抗性基因失活，就不能使碘青霉素抗性基因失活，就不能使碘-青青霉素指示液褪色霉素指示液褪色-呈呈蓝灰色据此选据此选择择阳性克隆阳性克隆图图 氨苄青霉素抗性插入失活氨苄青霉素抗性插入失活三、利用三、利用-半乳糖苷酶显色半乳糖苷酶显色n选择重组子的原理选择重组子的原理1.-半乳糖苷酶与半乳糖苷酶与Lac Z基因基因n由由E.coli lac操纵子上的操纵子上的Lac Z基因编码基因编码分解乳糖生成葡萄糖和半乳糖分解乳糖生成葡萄糖和半乳糖2.Lac Z 基因基因n突变的突变的Lac Z基因，只编码基因，只编码-半乳糖苷半乳糖苷酶的酶的部分肽段部分肽段（氨基端）（氨基端）2.培养基中培养基中IPTG、X-gal 的作用的作用（1）IPTG作用作用n异丙基硫代异丙基硫代-D-半乳糖苷是诱导物，可诱导半乳糖苷是诱导物，可诱导lacZ 基因的表达基因的表达-半乳糖苷酶。

半乳糖苷酶2）X-gal作用作用n5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D-半乳糖苷作为半乳糖苷作为-半乳半乳糖苷酶水解的底物糖苷酶水解的底物3）X-gal的显色反应的显色反应n-半乳糖苷酶半乳糖苷酶(四聚体四聚体)将将X-gal水解成半乳糖苷水解成半乳糖苷和和蓝色蓝色的吲哚衍生物的吲哚衍生物(靛蓝靛蓝)在4蓝色加深蓝色加深n-互补作用是互补作用是pUC质粒质粒载体的特性载体的特性npUC载体：载体：含有含有Lac Z 基因，编码基因，编码-半乳糖苷酶半乳糖苷酶的部分肽段（的部分肽段（片段，氨基端）片段，氨基端）n受体菌：受体菌：基因组中带有基因组中带有突变的突变的-半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因（缺失（缺失 片段），可被片段），可被IPTG诱导表达（只编码诱导表达（只编码-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的-肽）n载体和受体菌基因组互补：载体和受体菌基因组互补：只有当受体菌吸收了带只有当受体菌吸收了带有有LacZ 基因的基因的 pUC质粒，才能合成完整的有活质粒，才能合成完整的有活性的性的-半乳糖苷酶半乳糖苷酶3.-互补作用互补作用n氨苄青霉素抗性基因氨苄青霉素抗性基因nLac Z 基因：编码基因：编码-半乳糖苷酶的部半乳糖苷酶的部分肽段。

分肽段nLac Z 上有插入外源上有插入外源DNA的的MCS位点pUC18/19的结构图的结构图n利用蓝白斑法筛选利用蓝白斑法筛选pUC8/9重组子，是一重组子，是一种直接检测种直接检测-半乳糖苷酶活性的方法半乳糖苷酶活性的方法n先将转化子涂于含有氨苄青霉素的培先将转化子涂于含有氨苄青霉素的培养基，能合成养基，能合成-半乳糖苷酶半乳糖苷酶n然后再通过检测然后再通过检测-半乳糖苷酶的活性，半乳糖苷酶的活性，来选择重组子，如果既能抗氨苄青霉素，来选择重组子，如果既能抗氨苄青霉素，又能合成又能合成-半乳糖苷酶的细胞，就是重半乳糖苷酶的细胞，就是重组子细胞组子细胞4.筛选的方法：蓝白斑法筛选的方法：蓝白斑法n-半乳糖苷酶分解半乳糖苷酶分解X-gal的显色反应的显色反应很灵敏当在含有氨卡青霉素、很灵敏当在含有氨卡青霉素、X-gal、IPDG的培养基中，那些能合成完整的的培养基中，那些能合成完整的-半乳糖苷酶的非重组子克隆，会因它半乳糖苷酶的非重组子克隆，会因它能分解能分解X-gal而变成蓝色；而变成蓝色；而重组子而重组子克隆因克隆因Lac Z 基因被破坏，不能合成基因被破坏，不能合成完整的完整的-半乳糖苷酶，故不能分解半乳糖苷酶，故不能分解X-gal而呈白色。

而呈白色5.选择培养的原理选择培养的原理n在含有在含有X-gal 和和IPTG 的选择培养基上，的选择培养基上，载体上载体上没有没有插入片段的转化子为插入片段的转化子为蓝色蓝色菌菌落，而落，而携带携带插入片段的重组质粒转化子插入片段的重组质粒转化子为为白色白色菌落n平板平板37培养后，放于冰箱培养后，放于冰箱3-4 小时，小时，可使显色反应充分，菌落为蓝色可使显色反应充分，菌落为蓝色图图 -半乳糖苷酶显色反应半乳糖苷酶显色反应*-半乳半乳糖苷酶糖苷酶 乳糖乳糖半乳糖半乳糖葡萄糖葡萄糖X-gal半乳糖半乳糖5-溴溴-4-氯靛蓝氯靛蓝+蓝色蓝色图图 LacZ 插入外源插入外源DNA图图 白色菌落与蓝色菌落的挑选白色菌落与蓝色菌落的挑选四、四、pBS重组质粒的筛选实验重组质粒的筛选实验n使用的载体为使用的载体为pBS质粒n转化受体菌为转化受体菌为E.coli DH5菌株n由于由于pBS上带有上带有Ampr 和和lacZ 基因，故基因，故重组子的筛选采用重组子的筛选采用Amp 抗性筛选与抗性筛选与-互互补现象筛选补现象筛选相结合的方法相结合的方法载体载体n-供体供体为羧基末端缺失的为羧基末端缺失的-半乳糖苷酶。

半乳糖苷酶如如pUC、pGEM系列载体系列载体菌株菌株n-受体受体为氨末端缺失的为氨末端缺失的-半乳糖苷酶半乳糖苷酶如如DH5(LacZM15)、JM101110(LacZM15)等1.抗性筛选抗性筛选n因因pBS质粒带有质粒带有Ampr 基因，而外源基因，而外源DNA片段上不带该基因，故转化受体菌片段上不带该基因，故转化受体菌后，只有带有后，只有带有pBS DNA 的转化子，才的转化子，才能在含有能在含有Amp 的的LB 平板上存活下来；平板上存活下来；而只带有自身环化的外源而只带有自身环化的外源DNA片段的转片段的转化子则不能存活此为初步的抗性筛选化子则不能存活此为初步的抗性筛选2.lacZ 基因的插入失活基因的插入失活npBS质粒上带有质粒上带有-半乳糖苷酶基因的半乳糖苷酶基因的调调控序列和控序列和-半乳糖苷酶半乳糖苷酶N 端端146 个氨基个氨基酸的编码序列酸的编码序列该编码区有一个多克隆该编码区有一个多克隆位点，但并不破坏位点，但并不破坏lacZ 的阅读框架，不的阅读框架，不影响其正常功能影响其正常功能3.DH5菌株菌株nE.coli DH5菌株带有菌株带有-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的C端的部分编码序列。

端的部分编码序列n在各自独立的情况下，在各自独立的情况下，pBS 和和DH5编编码的码的-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性半乳糖苷酶的片段都没有酶活性但在但在pBS 和和DH5融为一体时，可形成融为一体时，可形成具有具有-半乳糖苷酶活性的蛋白质半乳糖苷酶活性的蛋白质4.-互补现象互补现象nlacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的体与带有完整的近操纵基因区段的-半半乳糖苷酶阴性突变体之间实现互补的现乳糖苷酶阴性突变体之间实现互补的现象n由由-互补产生的互补产生的Lac+细菌较易识别，它细菌较易识别，它在生色底物在生色底物X-gal 存在下，被存在下，被IPTG 诱导，诱导，形成形成蓝色菌落蓝色菌落n当外源当外源DNA片段插入到片段插入到pBS 质粒的多克质粒的多克隆位点后，导致读码框架改变，表达蛋隆位点后，导致读码框架改变，表达蛋白失活，产生的肽段失去白失活，产生的肽段失去-互补能力互补能力因此，在同样条件下，含重组质粒的转因此，在同样条件下，含重组质粒的转化子，在生色诱导培养基上，只能形成化子，在生色诱导培养基上，只能形成白色菌落白色菌落。

互补作用互补作用/现象现象n当当pUC质粒转化质粒转化LacZ基因的氨基未端编。