稀释平板测数法.doc

稀释平板测数法一、实验目的了解稀释平板计数的原理，掌握涂抹平板培养法和混合平板培养法，认识细菌、放线菌、霉菌的菌落特征二、实验原理稀释平板计数是根据微生物在固体培养基上所形成的单个菌落，即是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征设计的计数方法，即一个菌落代表一个单细胞计数时，首先将待测样品制成均匀的系列稀释液，尽量使样品中的微生物细胞分散开，使成单个细胞存在（否则一个菌落就不只是代表一个细胞），再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可计算岀样品中的含菌数此法所计算的菌数是培养基上长岀来的菌落数，故又称活菌计数一般用于某些成品检定（如杀虫菌剂等）、生物制品检验、土壤含菌量测定及食品、水源的污染程度的检验三、实验器材1.活材料：苏云金芽抱杆菌（Bacillusthuringiensis）菌剂2 •培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（附录三、1）.器材：90ml无菌水、9ml无菌水、无菌平皿、Iml无菌吸管、天平、称样瓶、记号笔、玻璃刮铲等四、实验方法1•样品稀释液的制备准确称取待测样品I0g，放入装有90ml无菌水并放有小玻璃珠的250ml三角瓶中，用手或置摇床上振荡20min，使微生物细胞分散，静置20-30s，即成10-1稀释液；再用1ml无菌吸管，吸取10-1稀释液lml，移入装有9ml无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10-2稀释液1ml，移入装有9ml无菌水的试管中，也吹吸三次，即成10-3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9等一系列稀释菌液（图22-1）。

图22-1平板计数法中样品的稀释和稀释液的取样培养用稀释平板计数时，待测菌稀释度的选择应根据样品确定样品中所含待测菌的数量多时，稀释度应高，反之则低通常测定细菌菌剂含菌数时，采用io-7、io-8、io-9稀释度，测定土壤细菌数量时，采用io-4、io-5、io-6稀释度，测定放线菌数量时，采用io-3、io-4、io-5稀释度，测定真菌数量时，采用io-2、io-3、io-4稀释度2•平板接种培养平板接种培养有混合平板培养法和涂抹平板培养法两种方法i）混合平板培养法将无菌平板编上io-7、io-8、io-9号码，每一号码设置三个重复，用无菌吸管按无菌操作要求吸取io-9稀释液各iml放入编号io-9的3个平板中，同法吸取io-8稀释液各Iml放入编号io-8的3个平板中，再吸取io-7稀释液各Iml放入编号io-7的3个平板中（由低浓度向高浓度时，吸管可不必更换）然后在9个平板中分别倒入已融化并冷却至45—5oC的细菌培养基（图22-2），轻轻转动平板，使菌液与培养基混合均匀，冷疑后倒置，适温培养至长岀菌落后即可计数2）涂抹平板计数法涂抹平板计数法与混合法基本相同，所不同的是先将培养基熔化后趁热倒入无菌平板中，待凝固后编号，然后用无菌吸管吸取o.iml菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上（每个编号设三个重复）。

再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀（图22-3），每个稀释度用一个灭菌刮铲，更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌在由低浓度向高浓度涂抹时，也可以不更换刮铲将涂抹好的平板平放于桌上2o—3omin，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，保温培养，至长出菌落后即可计数五、实验作业：将实验结果填入下表中稀释度-710-810-910菌落数123平均123平均123平均1g样品活菌数计算结果时，常按下列标准从接种后的3个稀释度中选择一个合适的稀释度，求出每克菌剂中的含菌数1同一稀释度各个重复的菌数相差不太悬殊2）细菌、放线菌、酵母菌以每皿30—300个菌落为宜，霉菌以每皿10—100个菌落为宜选择好计数的稀释度后，即可统计在平板上长岀的菌落数，统计结果按下式计算混合平板计数法：每克样品的菌数=同一稀释度几次重复的菌落平均数X稀释倍数涂抹平板计效法：每克样品的菌数=同一稀释度几次重复的菌落平均数X10X稀释倍数。