植物细胞融合.docx

植物细胞融合、细胞融合的目的和意义细胞融合能实现远缘杂交其意义在于打破了仅仅依赖有性杂交重组基因创造新种 的界限，有可能形成有性杂交方法无法获得的新型杂种植物，广泛组合各种基因型，扩 大了遗传物质的重组范围二、 细胞融合（cell fusion）概念在外力（诱导剂或促融合剂）作用下，两个或两个以上的异源细胞或原生质体相互 接触，从而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞的现象通过细胞培养技术，这个细胞有可能发育成完整的生物个体，这个杂种后代有可能 兼有两个上代的一些优良性状三、 PEG诱导原生质体融合的机理：带有大量负电荷的PEG与水之间的氢键结合，使溶液中自由水消失，由于高度脱 水引起原生质体凝集，形成大小程度不同的凝集物原生质体发生皱缩并大大扭曲变形， 邻近原生质体之间紧密接触在原生质体细胞膜与膜紧密接触的部位，膜内蛋白质颗粒 易位并凝聚接着可能是相邻的剥去蛋白质的细胞膜间的类脂质与类脂质反应继之， 类脂质分子的扰动和重排导致接触的细胞膜局部发生融合，形成很小的细胞质桥，之后 它逐渐扩大，两个原生质体最终融合使用化学促融剂时，Ca2+是必需的关于Ca2+的 作用机理，有的认为是Ca2+和PO43-形成不溶于水的配合物，成为细胞间的钙桥，由此 引起融合。

也有解释为Ca2+结合到带负电磷脂的电离基上，使磷脂分子在膜上相互分离， 由此引起融合四、实验材料、试剂和仪器1. 材料：无菌烟草叶片、洋葱根尖2. 试剂1）酶混合液，配制分两部进行：a. 将 CaCl22H2ONaH2PO42H2OMES甘露醇用重蒸馏水溶解，b. 使用时再加入：纤维素酶R-10果胶酶R-107 mmol/L (1.029g/L)0.7mmol/L (0.1092g/L)3 mmol/L (0.585g/L？)0.5 mmol/L(0.0911g/L)调pH5.6，定容为酶储备液，灭菌备用0.8%1%2）3）30%(w/v)(即 300g/L) 0.01mol/L 0.00074mol/L 0.1 mol/L（因酶制剂经过高压灭菌处理后会失活，故先将酶储液灭菌，待用时再将酶制剂按比例加入到第一步已灭菌的酶液内配制 CaCl22H2O 0.16mol/L（23.52g/L）（pH5.8-6.2 用于悬浮原生质体）PEG液（用时现配）：PEG （MW=6000）CaCl22H2OKH2PO4山梨醇（分子式：C6H14O6）调 pH 5.8-6.23. 仪器1）大型仪器：高压灭菌锅，超净工作台，离心机，倒置显微镜。

2） 一般器材：大小培养皿，小烧杯，小滴管，刻度离心管，小漏斗，不锈钢网300目五.实验步骤实验路线：烟草叶肉及洋葱根尖原生质体酶解分离一提纯原生质体并调整原生质体密 度一PEG法使原生质体融合一倒置显微镜观察并照相具体步骤：1. 取酶储液10ml，加入纤维素酶0.08g和果胶酶0.1g，制备酶液2. 取材：烟草、洋葱根尖各0.7g取洋葱根尖，并将其切成0.5cm长短大小放入小平皿中；取烟草叶片将其剪 成0.5cm2大小放入小平皿中3. 酶解：将酶液等量加入到存有实验材料的平皿中，放入25r培养箱酶解洋葱约4h，烟草约3h4. 观察酶解效果5. 原生质体的分离和纯化① 酶解后，用300目铜网过滤酶液，去除未酶解的杂质，将滤液收集在10ml离心 管中② 1000转/分离心3分钟，用吸管或移液枪弃上清（注意不要把收集的原生质体吸 走）③ 用CaCl2 - 2H2O （约1ml）悬浮下面的原生质体（PEG法）4显微镜观察提纯后的原生质体，若杂质较多可重复〜③操作6. 原生质体的密度测定用血细胞记数板记数每一样品测定3次，根据测定结果，将悬浮原生质体密 度调整至5X105个/ml7. 原生质体的融合PEG法1） 配制 PEG 液（5ml）30% （w/v） PEG（MW=6000） 1.5 gCaCl2 - 2H2O 0.0074gKH2PO4 0.0005 g山梨醇 0.0911g调 pH 5.8〜6.22） 将两种原生质体悬液等量混合3） 用刻度吸管将混合的原生质体悬液滴在直径为60mm的平皿中，每皿7~8滴， 每滴约0.1ml。

然后静置10分钟，使原生质体贴在皿底上，形成一薄层（应 有3~5个平皿的重复）4） 用吸管将等量的PEG溶液缓慢地加在原生质体液滴上，再静置10~15分钟 此时可取一个平皿在倒置显微镜上观察原生质体间的粘连。