毛细管电泳中的温度效应和温度梯度技术.pdf

文献综述?????毛细管电泳中的温度效应和温度梯度技术Ξ朱?亮?许?旭?林炳承? ??中国科学院大连化学物理研究所?大连????????提?要?对毛细管电泳中的温度效应及温度梯度的应用作了较为详尽的论述?引用文献??篇∀关键词?毛细管电泳?温度效应?温度梯度分类号?? ?????前言在过去??年中?毛细管电泳????已发展成为分析分离复杂化合物的一种强有力的工具?特别是在生物和生化领域中?毛细管电泳以其高效?快速?样品用量少?成本低等优点赢得越来越多科研人员的青睐???∀温度是气相色谱及液相色谱中的一个十分重要的参数????在毛细管电泳中?温度的波动也会影响实验的重复性?分离效率和分离度??????因此柱温的控制十分重要∀控温方式有气冷????液冷???和固体恒温???等??种方式的控温效率依次升高?装置的复杂程度也随之加大∀不论采用何种方式?柱温与管内温度都有差异?总是存在着毛细管内温度的径向分布∀温度的径向分布及管内平均温度的计算方法?现已有电渗流法?欧姆定律法????稳态下的微分方程法???和非稳态下的微分方程法????等∀柱温对毛细管电泳过程的影响非常复杂?视分离对象而异?有时差距甚远∀一般来说?温度升高将加快分离速度?降低分离效率和分离度∀研究毛细管电泳中的温度效应目的之一是寻找最佳的操作温度?但如果能够利用温度效应建立起合适的温度梯度?分离在一般条件下毛细管电泳不能分离的物质?则无疑具有更加重要的意义∀本文从温度效应的理论研究状况出发?针对不同的分离对象讨论了温度的影响?并着重讨论了毛细管电泳中的温度梯度∀??毛细管电泳中的温度效应????概述根据盎格萨的电导理论?????电解质溶液中的离子在电场的推动下泳动?有以下几种力对其发生作用????电场的电力????粒子在连续介质中移动遇到的摩擦力????松弛力?与松驰时间有关?????离子水化后增大的摩擦力?即电泳力∀电场力为动力?其它?种力为电泳阻力∀温度对离子的电荷?离子的水化数?离子的扩散系数?离子氛的厚度?离子的松弛时间?溶液的粘度?溶液的??值?溶液的介电常数和溶液中的化学反应等因素均有影响?这些因数又或多或少地影响着电场力和电泳阻力?影响的大小随具体的分离过程而变化?有时是主要因素?有时又影响甚小可以忽略不计∀其中温度对缓冲液粘度的影响在大多数情况下都是主要因素之一∀温度对缓冲液中的化学反应的影响会随分离对象的不同而有不同的特点∀温度可能改变生物大分子的结构和生物特性?也可能影响缓冲液中存在的包合?络合和溶质解离等过程平衡∀有些缓冲液如三?羟甲基?氨基甲烷?? ? ? ? ?溶液?其??值对温度敏感?在这种情况下?温度对??值的影响也是一个不可忽略的因素∀????温度对电渗流淌度?离子有效淌度???????和柱效????的影响在毛细管区带电泳中?电渗流淌度?Λ? ??和离子有效淌度?Λ? ??的计算公式为?Λ? ??ΕΝ ?ΠΓ???Λ? ??θ ?ΠΓρ???式中Ε?Γ为缓冲液的介电常数和粘度?Ν为?? ? ?电势?θ为离子的电荷∀温度对这?个参数都有影响?考虑最一般的情况?温度对粘度的影响是主要因素∀粘度Γ与温度Τ的关系为?Γ ?Α ?? ???∃Ε? Ρ Τ????其中Α为常数?∃Ε?为缓冲液的扩散活化能?Ρ为气体 常数∀将式???代入式???和式????在等式两边取对数得?? ? Λ? ?? ?∃Ε? Ρ Τ?Α????? ? Λ? ?? ?∃Ε? Ρ Τ?Α????第??卷第?期色?????谱? ?? ??? ???? ????年?月?? ? ???? ? ? ? ? ?? ?? ? ?? ? ? ? ? ? ? ?? ? ?? ?? ? ?? ????Ξ国家自然科学重点基金???????????中国科学院条件局资助项目 ? ?通讯联系人 ?本文收稿日期????????????修回日期???????????Α??Α?均为与温度无关的常数?其中Α?与具体的分离对象有关∀实验证实了? ? Λ? ?和? ? Λ? ?与温度的倒数呈线性关系?从而证明温度对粘度的影响是主要因素∀?? ? ? ?? ?????推导了毛细管凝胶电泳中理论塔板数和温度的关系∀在毛细管凝胶电泳中电渗流可视为零?离子的淌度?Λ?为?Λ ?Θ φ???离子的扩散系数?∆ ?为?∆ ?κΤ φ???理论塔板数?Ν ?的计算式为?Ν ?ΛΕλ ?∆???式???∗???中?Θ为离子的电荷?φ为摩擦系数?κ为玻尔兹曼常数?Ε为电场强度?λ为毛细管的有效长度∀合并式??? ∗???得?Ν ?Ελ Θ ?κΤ???由式???可以看出?如果离子的电荷不受温度的影响?则理论塔板数与温度的倒数成正比∀????温度对不同分离对象的影响??????分离???时的温度效应由于分离???所用的缓冲液通常都含有筛分剂?温度过高将会破坏筛分剂的结构?造成单链???构 象 发 生 变 化?降 低 分 离 效 率?破 坏 分 离度???∗ ????因此很多研究者在分离???时都采用室温??? ε左右?∀缓冲液的粘度通常很高?室温下分离速度太慢∀在分离某些???片段时?适当改变缓冲液的条件?可在高温下获得较好的结果∀?? ? ? ?等????比较了?? ε下和?? ε下双链???的分离效果?发现如果将筛分剂羟乙基纤维素? ??的质量分数提高到?? ?羟甲基纤维素? ?? ?的质量分数提高到??以上?双链???在?? ε下也能达到较高的分离效率∀高温下电泳的优点是????由于高温降低了缓冲液粘度?因此可减少分离时间?实验中减少约??? ?????对于较长???片段????∗ ??? ????可以检测到出峰时间与???片段的长度存性关系∀?? ? ?? ? ?? ?等????在?? ε和?? ε下对大于??? ??的???序列片段进行了分离∀?? ? ? ? ? ??等????在?? ε下对大于? ??? ??的? ? ? ??????模 板 进 行 了 序 列 分 析?准 确 率 大 于????? ∀? ? ? ?? ? ??等????在??∗ ?? ε之间用毛细管电泳分离合成寡核苷酸标准物?在??∗ ?? ε之间获得了最佳分离效率∀这表明有可能在高温下对???进行快速分离而不丧失分离效率∀另外值得一提的是??? ? ? ?等????发明了热敏感筛分剂?这种筛分剂受热后粘度急剧下降?因此可以很容易地在毛细管中进行填装和清除∀??????分离蛋白质?肽和氨基酸时的温度效应总体说来?温度升高?则迁移时间减少?分离度下降?柱效降低∀这个规律在分离蛋白质?肽和氨基酸时也同样适用∀但由于缓冲液的??值和蛋白质?肽?氨基酸的等电点都可能随温度而变?所以温度还可能影响蛋白质?肽和氨基酸所带的电荷∀陈农等????在分离聚甘氨酸肽时发现?在恒场强操作模式下柱温对迁移时间的影响比在恒流操作模式下大∀? ? ? ? ? ??? ??????等用聚?????亚乙基二醇?异丁烯酸丙烯酰胺共聚物???? ??? ? ??? ? ???? ?? ?? ??? ? ?? ? ?? ?? ? ? ? ?? ? ? ?? ? ?? ? ?? ???? ??? ? ? ???? ? ? ?作凝胶?这种凝胶可允许大电流通过??在柱温为? ??ε ?恒流操作电流为???∗ ??? ??的条件下?对?种疏水性蛋白质进行分离?分离速度比常温下用?????? ??体系快?倍?柱效高?倍∀温度的高低对分离蛋白质顺?反异构体非常重要∀? ?等????在分离两种二肽??? ??? ?和? ? ???? ?的顺?反异构体时发现?? ε时顺?反异构体得到完全分离??? ε时分离较差?所得两个峰的峰高比也不相同??? ε时则只能得到一个峰∀这可能与顺?反异构体间的转变速度有关?? ε时两种异构体来不及转变?因此可分离??? ε时已有部分异构体转变??? ε时则迅速转变为 一 种异 构 体∀他们 还 成功 地 在? ?? ε下对? ?? ??? ????? ?? ? ??? ? ? ??? ???? ?的两种异构体及? ?? ??? ????? ??? ??? ?? ??? ???? ? ??? ?的?种异构体进行了分离∀类似的现象在分离杂环亚硝胺酸的顺?反异构体时也有报道?????且不同的杂环亚硝胺酸因为其顺?反异构体的转变速率不同?可在不同的温度下得到分离∀同样?蛋白质的折叠与解折叠的转变过程与温度的关系也可通过??观察到????∀柱温还可引起蛋白质的化学成分发生变化∀? ? ? ?等????在分离肌红蛋白时发现?从?? ε到?? ε ?血红素中的?? ?? ?逐渐还原为?? ?? ?∀还原的机理有两种解释?一是缓冲液中存在还原性杂质?二是自动还原?肌红蛋白中的一个氨基酸残基作为还原剂∀如果缓冲液中有表面活性剂作为添加剂时?柱温还可能影响表面活性剂与蛋白质形成的络合物∀?? ? ? ? ?? ? ?等????以?? ? ?为添加剂分离?种碱性蛋白质?发现在?? ε时?种蛋白质完全分离?而在?? ε时分离被完全破坏了∀一种原因可能是蛋白质被热降解了?另一原因是蛋白质与?? ? ?间的相互作用改变了∀首先?温度的变化可能引起蛋白质的电荷发生变化?其次?蛋白质的疏水作用也受温度的影响?温????色????谱??卷度越高?疏水作用越强?这可能是导致实验中蛋白质??? ? ?络合物的淌度随温度的变化比电渗流淌度变化更大的原因∀? ?? ? ? ?????在用毛细管凝胶电泳分离????卵 清 蛋 白???? ? ?? ?? ??时 也 报 道 过 类 似 现象∀????????手性拆分中的温度效应? ?? ??等????在对苯乙醇酸进行手性拆分时发现一 个有趣的现象?尽管电渗流淌度Λ? ?随温度的改变而增加了?分离对象的有效淌度Λ? ?却减少了∀这可能与缓冲液中存在的分离对象与手性拆分剂?Χ????的络合平衡有关?Λ? ??Λ? ???? ? ?Κ ?χ?????Λ? ???为样品未络合时的绝对淌度?Κ为样品与??的结合常数??χ?为手性拆分剂的浓度∀如果温度升高?结合常数Κ增加?会使有效淌度Λ? ?减少?当Κ对Λ? ?的影响超过粘度Γ对Λ? ?的影响度时?就会导致Λ? ?随温度的增加而减少∀本文作者还发现温度增加时分离度也有轻微降低∀?? ??等????和? ? ? ? ? ?等????也报道过类似现象∀?? ?等????在对氨基酸进行手性拆分时?发现在?? ε时可以获得最佳的分离效率和分离度?这可能与他们所用的分离介质?一种包含Β???的环糊精聚合物?有关∀朱晓峰????在拆分两种手性化合物? ? ? ? ?? ?? ? ? ??和??? ? ? ?? ? ? ? ??时发现?温度对二者的分离度有完全相反的影响∀前者的分离度随温度的升高而增大?可认为其与环糊精的包合作用是吸热过程?温度的增加有利于包合作用?后者的分离度则随温度的降低而增大?即其包合作用是放热过程?降低温度有利于包合作用∀可见过程的热效应不同?对温度所产生的响应趋势也就不同∀??????分离糖时的温度效应温度也会影响糖与硼酸的络合平衡????∀在硼酸存在的情况下分离?个单糖甘露糖?半乳糖?葡萄糖?木糖?在?? ε时峰非常宽且葡萄糖与木糖不能分开??? ε时?由于反应速率提高?糖与硼酸迅速达到络合平衡??? ?? ?内?个单糖达到基线分离∀? ? ?等????和?? ? ? ?? ?等????都报道了寡糖的迁移速度随温度升高而增加?前者发现衍生的寡糖在低温下分离度最佳?未衍生的寡糖在高温下分离度更好?后者报道对于不大于??个葡萄糖单位的已衍生的寡糖?即使温度高达?? ε ?仍有足够的分离度使分离在? ?? ?内完成∀??????其它?? ? ?? ?等????对二十一萘磺酸盐进行分离时发现低温的意义不大∀尽管低温会提高分离效率?但实际上从? ? ε到室温??? ε左右??分离效率降低不大?而分离时间从?? ? ? ?减至?? ?? ?∀?? ? ?? ?? ?????等研究了温度对分离无机阴离子的影响。