酵母表达系统ppt课件.ppt

真菌基因工程真菌基因工程真菌基因工程真菌基因工程三、酵母表达系三、酵母表达系统统二、酵母二、酵母转转化系化系统统一、真菌表达系一、真菌表达系统统的的优优缺陷缺陷四、四、丝丝状真菌表达系状真菌表达系统统三三三三 酵母表达系统酵母表达系统酵母表达系统酵母表达系统甲醇酵母表达系甲醇酵母表达系甲醇酵母表达系统统统酿酿酿酒酵母表达系酒酵母表达系酒酵母表达系统统统其它酵母表达系其它酵母表达系其它酵母表达系统统统〔一〕〔一〕〔一〕〔一〕 酿酒酵母表达系统酿酒酵母表达系统酿酒酵母表达系统酿酒酵母表达系统酿酿酿酒酵母分泌系酒酵母分泌系酒酵母分泌系统统统酿酿酿酒酵母系酒酵母系酒酵母系统统统启启启动动动子子子酿酿酿酒酵母表达系酒酵母表达系酒酵母表达系统统统存在的存在的存在的问题问题问题酿酿酿酒酵母糖基化系酒酵母糖基化系酒酵母糖基化系统统统1 1、、、、酿酿酿酿酒酵母启酒酵母启酒酵母启酒酵母启动动动动子子子子UASURSTATA起始起始位点位点编码序列编码序列mRNA40-120bp20-40bp100-1400bp1、转录起始位点；、转录起始位点； 4、、URS：上游阻遏序列：上游阻遏序列2、、TATA盒：富含盒：富含AT；； 5、、DAS：下游激活序列：下游激活序列3、、UAS：上游激活序列：上游激活序列;DAS1 1 1〕 〕 〕 〕 〕 〕糖酵解途径中关糖酵解途径中关糖酵解途径中关糖酵解途径中关糖酵解途径中关糖酵解途径中关键键键键键键酶酶酶酶酶酶的的的的的的强强强强强强启启启启启启动动动动动动子，受葡萄糖子，受葡萄糖子，受葡萄糖子，受葡萄糖子，受葡萄糖子，受葡萄糖诱导诱导诱导诱导诱导诱导：：：：：： 甘油甘油甘油甘油甘油甘油醛醛醛醛醛醛-3--3--3-磷酸脱磷酸脱磷酸脱磷酸脱磷酸脱磷酸脱氢氢氢氢氢氢酶酶酶酶酶酶基因基因基因基因基因基因GAPDHGAPDHGAPDH 磷酸甘油激磷酸甘油激磷酸甘油激磷酸甘油激磷酸甘油激磷酸甘油激酶酶酶酶酶酶基因基因基因基因基因基因PKGPKGPKG 乙醇脱乙醇脱乙醇脱乙醇脱乙醇脱乙醇脱氢氢氢氢氢氢酶酶酶酶酶酶基因基因基因基因基因基因ADHADHADH酿酿酒酵母表达系酒酵母表达系酒酵母表达系酒酵母表达系统统常用启常用启常用启常用启动动子子子子2 2〕 〕 〕 〕半乳糖激半乳糖激半乳糖激半乳糖激酶酶酶酶启启启启动动动动子子子子〔 〔 〔 〔GAL1GAL1〕 〕 〕 〕GAL1GAL1GAL1GAL7GAL7GAL7GAL10GAL10GAL10UASUASUASGAL4GAL4GAL4GAL80GAL80GAL80A AA、、、 GAL1 GAL1 GAL1、、、GAL7GAL7GAL7和和和 GAL10 GAL10 GAL10基因基因基因连锁连锁连锁在一同，独立在一同，独立在一同，独立转录转录转录，共同，共同，共同调调调控控控B BB、、、GAL4GAL4GAL4产产产物与物与物与UASUASUAS结结结合，促合，促合，促进转录进转录进转录；；；GAL80GAL80GAL80产产产物抑制物抑制物抑制GAL4GAL4GAL4产产产物的活性，阻遏物的活性，阻遏物的活性，阻遏转录转录转录C CC、野生型、野生型、野生型GAL4GAL4GAL4表达程度低，表达程度低，表达程度低，产产产物活性可被物活性可被物活性可被GLAL80GLAL80GLAL80产产产物完全抑制，半乳糖物完全抑制，半乳糖物完全抑制，半乳糖诱导诱导诱导效果差效果差效果差半乳糖诱导、葡萄糖抑制半乳糖诱导、葡萄糖抑制2 2〕 〕 〕 〕半乳糖激半乳糖激半乳糖激半乳糖激酶酶酶酶启启启启动动动动子子子子〔 〔 〔 〔GAL1GAL1〕 〕 〕 〕GAL1GAL1GAL1GAL7GAL7GAL7GAL10GAL10GAL10UASUASUASGAL4GAL4GAL4GAL80GAL80GAL80A AA、、、 将将将GAL4GAL4GAL4的启的启的启动动动子子子换换换成成成GAL10GAL10GAL10的的的诱导诱导诱导型型型强强强启启启动动动子子子B BB、半乳糖、半乳糖、半乳糖诱导诱导诱导GAL4GAL4GAL4高表达，不受高表达，不受高表达，不受GAL80GAL80GAL80产产产物抑制，激活物抑制，激活物抑制，激活GAL1GAL1GAL1等高效等高效等高效转录转录转录半乳糖诱导、葡萄糖抑制半乳糖诱导、葡萄糖抑制PromoterPromoterPromoterGAL10GAL10GAL103 3 3 3〕 〕 〕 〕pho4TS-PHO5pho4TS-PHO5pho4TS-PHO5pho4TS-PHO5启启启启动动动动子子子子A A A、、、PHO5PHO5PHO5启启启动动动子在培育基缺磷酸子在培育基缺磷酸子在培育基缺磷酸盐时盐时盐时启启启动转录动转录动转录B B B、、、PHO4PHO4PHO4基因基因基因编码产编码产编码产物是物是物是PHO5PHO5PHO5启启启动动动子的正子的正子的正调调调控因子控因子控因子C C C、、、pho4TS pho4TS pho4TS 温度敏感，温度敏感，温度敏感，353535℃℃℃时时时失活，失活，失活，PHO5PHO5PHO5封封封锁锁锁D D D、、、pho4TS-PHO5pho4TS-PHO5pho4TS-PHO5启启启动动动子子子经过经过经过降温降温降温〔 〔 〔232323℃℃℃〕 〕 〕诱导诱导诱导表达表达表达低温低温低温诱导诱导诱导、磷酸、磷酸、磷酸盐盐盐抑制抑制抑制酿酿酿酒酵母系酒酵母系酒酵母系统统统常用分泌信号常用分泌信号常用分泌信号肽肽肽来源：来源：来源： 性性性结结结合因子：合因子：合因子：MF-αMF-αMF-α 酸性磷酸酸性磷酸酸性磷酸酯酶酯酶酯酶：：：PHO5PHO5PHO5 蔗糖蔗糖蔗糖酶酶酶：：：SUC2SUC2SUC2 杀杀杀手毒素因子：手毒素因子：手毒素因子：KILKILKIL2 2、、、、酿酿酿酿酒酵母分泌系酒酵母分泌系酒酵母分泌系酒酵母分泌系统统统统* * *保守性低，大多异源宿主系保守性低，大多异源宿主系保守性低，大多异源宿主系统统统的信号的信号的信号肽肽肽不能互用不能互用不能互用* * *信号信号信号肽肽肽构造：构造：构造： 酿酿酒酵母信号酒酵母信号酒酵母信号酒酵母信号肽肽特点特点特点特点正电荷区正电荷区疏水区疏水区极性区极性区Met目的蛋白目的蛋白信号肽剪切位点信号肽剪切位点* * *分泌效率高分泌效率高分泌效率高* * *在酵母系在酵母系在酵母系统统统具有通用性具有通用性具有通用性*88*88*88个残基个残基个残基组组组成成成 MF-αMF-α信号信号信号信号肽肽肽肽Met目的蛋白目的蛋白-Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala-KEX2DAPDAPDAP：：STE13编码的二肽酶编码的二肽酶糖基化位点：糖基化位点：糖基化位点：糖基化位点：糖基化位点：糖基化位点：Asn-X-Thr/SerAsn-X-Thr/SerAsn-X-Thr/Ser〔〔〔〔〔〔X X X代表任何氨基酸〕代表任何氨基酸〕代表任何氨基酸〕代表任何氨基酸〕代表任何氨基酸〕代表任何氨基酸〕 N- N- N-型糖基化：天型糖基化：天型糖基化：天型糖基化：天型糖基化：天型糖基化：天门门门冬冬冬冬冬冬酰酰酰氨酸残基上的氨酸残基上的氨酸残基上的氨酸残基上的氨酸残基上的氨酸残基上的酰酰酰胺氮胺氮胺氮胺氮胺氮胺氮进进进展糖展糖展糖展糖展糖展糖 基化，基化，基化，基化，基化，基化，对对对蛋白蛋白蛋白蛋白蛋白蛋白质质质的折叠、的折叠、的折叠、的折叠、的折叠、的折叠、稳稳稳定性及活性定性及活性定性及活性定性及活性定性及活性定性及活性较较较重要。

重要 O- O- O-型糖基化：型糖基化：型糖基化：型糖基化：型糖基化：型糖基化：苏苏苏氨酸氨酸氨酸氨酸氨酸氨酸/ / /丝丝丝氨酸上的氨酸上的氨酸上的氨酸上的氨酸上的氨酸上的羟羟羟基氧基氧基氧基氧基氧基氧进进进展糖基化展糖基化展糖基化展糖基化展糖基化展糖基化 3 3、、、、酿酿酿酿酒酵母糖基化系酒酵母糖基化系酒酵母糖基化系酒酵母糖基化系统统统统* * * 过过过糖基化〔超糖基化修糖基化〔超糖基化修糖基化〔超糖基化修糖基化〔超糖基化修糖基化〔超糖基化修糖基化〔超糖基化修饰饰饰〕：〕：〕：〕：〕：〕： N N N型或型或型或型或型或型或O OO型糖基的外型糖基的外型糖基的外型糖基的外型糖基的外型糖基的外链进链进链进一步构成一步构成一步构成一步构成一步构成一步构成庞庞庞大的、由甘露糖大的、由甘露糖大的、由甘露糖大的、由甘露糖大的、由甘露糖大的、由甘露糖组组组成的、复成的、复成的、复成的、复成的、复成的、复杂杂杂分支构造的景象添加了免疫原性、分支构造的景象添加了免疫原性、分支构造的景象添加了免疫原性、分支构造的景象。

添加了免疫原性、分支构造的景象添加了免疫原性、分支构造的景象添加了免疫原性、对对对活活活活活活性与性与性与性与性与性与药药药代代代代代代稳稳稳定性均有影响定性均有影响定性均有影响定性均有影响定性均有影响定性均有影响 * *糖糖糖糖糖糖链组链组链组成成成成成成 O O O型糖型糖型糖型糖型糖型糖链仅链仅链仅由甘露糖由甘露糖由甘露糖由甘露糖由甘露糖由甘露糖组组组成、而哺乳成、而哺乳成、而哺乳成、而哺乳成、而哺乳成、而哺乳细细细胞的胞的胞的胞的胞的胞的还还还含唾液酸含唾液酸含唾液酸含唾液酸含唾液酸含唾液酸基基基基基基团团团酿酿酒酵母糖基化特点酒酵母糖基化特点酒酵母糖基化特点酒酵母糖基化特点1 1 1〕 〕 〕 〕 〕 〕表达程度普遍不高表达程度普遍不高表达程度普遍不高表达程度普遍不高表达程度普遍不高表达程度普遍不高 A A A、表达、表达、表达、表达、表达、表达载载载载载载体体体体体体传传传传传传代不代不代不代不代不代不稳稳稳稳稳稳定定定定定定〔 〔 〔 〔 〔 〔YEpYEpYEp、、、、、、YRpYRpYRp〕 〕 〕 〕 〕 〕 B B B、所采用的、所采用的、所采用的、所采用的、所采用的、所采用的强强强强强强启启启启启启动动动动动动子子子子子子调调调调调调控不控不控不控不控不控不严谨严谨严谨严谨严谨严谨 C C C、不能利用、不能利用、不能利用、不能利用、不能利用、不能利用简单简单简单简单简单简单的无机培育基的无机培育基的无机培育基的无机培育基的无机培育基的无机培育基进进进进进进展高密度展高密度展高密度展高密度展高密度展高密度发发发发发发酵酵酵酵酵酵2 2 2〕 〕 〕 〕 〕 〕分泌表达分泌表达分泌表达分泌表达分泌表达分泌表达产产产产产产物物物物物物过过过过过过糖基化糖基化糖基化糖基化糖基化糖基化4 4、、、、酿酿酿酿酒酵母表达系酒酵母表达系酒酵母表达系酒酵母表达系统统统统的缺陷的缺陷的缺陷的缺陷〔二〕〔二〕〔二〕〔二〕 甲醇酵母表达系统甲醇酵母表达系统甲醇酵母表达系统甲醇酵母表达系统甲醇酵母与甲醇氧化甲醇酵母与甲醇氧化甲醇酵母与甲醇氧化酶酶酶启启启动动动子子子甲醇酵母表达系甲醇酵母表达系甲醇酵母表达系统统统的运用的运用的运用甲醇酵母表达系甲醇酵母表达系甲醇酵母表达系统统统操作原理操作原理操作原理甲醇酵母系甲醇酵母系甲醇酵母系统统统高效表达影响要素与高效表达影响要素与高效表达影响要素与对对对策策策甲醇酵母表达系甲醇酵母表达系甲醇酵母表达系统统统的的的优优优缺陷缺陷缺陷1 1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子甲醇酵母〔甲醇酵母〔甲醇酵母〔methylotrophic yeast)methylotrophic yeast)methylotrophic yeast) 指可利用甲醇作指可利用甲醇作指可利用甲醇作单单单一碳源的一一碳源的一一碳源的一类类类酵母。

酵母 毕毕毕赤酵母〔赤酵母〔赤酵母〔Pichia pastoris)Pichia pastoris)Pichia pastoris) 汉汉汉森酵母〔森酵母〔森酵母〔Hansenula ploymorpha)Hansenula ploymorpha)Hansenula ploymorpha) 假假假丝丝丝酵母〔酵母〔酵母〔Candia boidinii) Candia boidinii) Candia boidinii) 1 1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子甲醇氧化甲醇氧化甲醇氧化酶酶酶A A A、甲醇代、甲醇代、甲醇代谢谢谢关关关键酶键酶键酶，占可溶蛋白的，占可溶蛋白的，占可溶蛋白的30%30%30%以上以上以上 B B B、称号和拷、称号和拷、称号和拷贝贝贝数不同数不同数不同毕毕毕赤酵母赤酵母赤酵母/ / /假假假丝丝丝酵母酵母酵母 汉汉汉森酵母森酵母森酵母 醇氧化醇氧化醇氧化酶酶酶 甲醇氧化甲醇氧化甲醇氧化酶酶酶alcohol oxidase,AOX methanol oxidase,MOXalcohol oxidase,AOX methanol oxidase,MOXalcohol oxidase,AOX methanol oxidase,MOXAOX1AOX1AOX1、、、AOX2 MOX AOX2 MOX AOX2 MOX 1 1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子AOX1AOX1AOX1与与与与与与AOX2AOX2AOX2* * *毕毕毕毕毕毕赤酵母和假赤酵母和假赤酵母和假赤酵母和假赤酵母和假赤酵母和假丝丝丝丝丝丝酵母基因酵母基因酵母基因酵母基因酵母基因酵母基因组组组组组组存在二个存在二个存在二个存在二个存在二个存在二个AOXAOXAOX基因基因基因基因基因基因 AOX1 AOX1 AOX1、、、、、、AOX2AOX2AOX2*AOX1*AOX1*AOX1与与与与与与AOX2AOX2AOX2基因基因基因基因基因基因97%97%97%同源同源同源同源同源同源*AOX1 *AOX1 *AOX1 占主占主占主占主占主占主导导导导导导位置，担任位置，担任位置，担任位置，担任位置，担任位置，担任AOX 99%AOX 99%AOX 99%以上活性以上活性以上活性以上活性以上活性以上活性1 1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子甲醇氧化甲醇氧化甲醇氧化酶酶酶启启启动动动子子子A A A、目前已、目前已、目前已发现发现发现的、最的、最的、最强强强的真核启的真核启的真核启动动动子子子B B B、、、严谨调严谨调严谨调控型启控型启控型启动动动子子子 AOX1 AOX1 AOX1：葡萄糖和甘油脱阻遏、甲醇：葡萄糖和甘油脱阻遏、甲醇：葡萄糖和甘油脱阻遏、甲醇诱导诱导诱导 MOX MOX MOX：葡萄糖阻遏、甘油脱阻遏、甲醇：葡萄糖阻遏、甘油脱阻遏、甲醇：葡萄糖阻遏、甘油脱阻遏、甲醇诱导诱导诱导 2 2、甲醇酵母表达系统的优缺陷、甲醇酵母表达系统的优缺陷、甲醇酵母表达系统的优缺陷、甲醇酵母表达系统的优缺陷A A A、表达程度高、表达程度高、表达程度高〔 〔 〔最高程度的系最高程度的系最高程度的系统统统〕 〕 〕B B B、、、产产产物可翻物可翻物可翻译译译后修后修后修饰饰饰：糖基化、磷酸化、：糖基化、磷酸化、：糖基化、磷酸化、酰酰酰脂化脂化脂化C C C、、、过过过糖基化程度比糖基化程度比糖基化程度比酿酿酿酒酵母少酒酵母少酒酵母少〔 〔 〔8-158-158-15个个个vs100-150vs100-150vs100-150 个甘露糖个甘露糖个甘露糖〕 〕 〕D D D、、、产产产物可正确折叠和高效分泌物可正确折叠和高效分泌物可正确折叠和高效分泌〔 〔 〔最高分泌表达系最高分泌表达系最高分泌表达系统统统〕 〕 〕E E E、可利用、可利用、可利用简单简单简单无机无机无机盐盐盐培育基高密度培育基高密度培育基高密度发发发酵，生物量大。

酵，生物量大酵，生物量大F F F、、、实验实验实验室和工室和工室和工业业业操作操作操作简单简单简单G GG、不能、不能、不能满满满足构造要求足构造要求足构造要求严厉严厉严厉的糖基化的糖基化的糖基化 3 3、甲醇酵母表达系统操作原理、甲醇酵母表达系统操作原理、甲醇酵母表达系统操作原理、甲醇酵母表达系统操作原理宿主株与宿主株与宿主株与标标标志基因志基因志基因甲醇酵母系甲醇酵母系甲醇酵母系统统统的整合事件的整合事件的整合事件胞内表达与分泌表达胞内表达与分泌表达胞内表达与分泌表达甲醇酵母系统宿主甲醇酵母系统宿主甲醇酵母系统宿主甲醇酵母系统宿主二大宿主系二大宿主系二大宿主系统统统主要特点主要特点主要特点工程工程 毕赤酵母毕赤酵母 汉森酵母汉森酵母最适温度最适温度 30℃ 37℃最适最适pH值 4.5 4.5甘油阻遏甘油阻遏 是是 否否糖基化糖基化 部分部分过度度 较正常正常高密度高密度发酵酵 100g/L 100g/L 甲醇酵母系统宿主甲醇酵母系统宿主甲醇酵母系统宿主甲醇酵母系统宿主二大宿主系二大宿主系二大宿主系统统统主要主要主要选择标选择标选择标志志志宿主 选择标志毕赤酵母毕赤酵母 his4、、G418、、 Zeocin、、Cu++汉森酵母汉森酵母 leu2、、 his3 、、ura3、、 G418甲醇酵母系统宿主甲醇酵母系统宿主甲醇酵母系统宿主甲醇酵母系统宿主毕毕毕赤酵母系赤酵母系赤酵母系赤酵母系赤酵母系赤酵母系统统统主要宿主株主要宿主株主要宿主株主要宿主株主要宿主株主要宿主株宿主株 特点 Y11430 野生型、野生型、Mut+GS115 his4- 、、Mut+KM71 his4-、、 aox1::ARG4 (AOX1-)、、Muts SMD1168 his4- 、胞外蛋白酶缺陷，高分泌、胞外蛋白酶缺陷，高分泌MC1003 his4-、、AOX1-、、AOX2-，甲醇不生长，甲醇不生长甲醇酵母系统的整合事件甲醇酵母系统的整合事件甲醇酵母系统的整合事件甲醇酵母系统的整合事件YRpYRpYRp型型型载载载体：体：体：汉汉汉森系森系森系统统统 传传传代不代不代不稳稳稳定，定，定，传传传代代代过过过程同源或非同源重程同源或非同源重程同源或非同源重组组组，高，高，高选择选择选择压压压力迫使高拷力迫使高拷力迫使高拷贝贝贝数整合，可达数整合，可达数整合，可达100100100拷拷拷贝贝贝。

YIpYIpYIp型型型载载载体：体：体：A A A、在靶序列、在靶序列、在靶序列处线处线处线性化性化性化载载载体体体DNADNADNA，，，诱导诱导诱导同源重同源重同源重组组组B B B、有、有、有“ “ “插入〞和插入〞和插入〞和“ “ “取代〞二取代〞二取代〞二类类类整合方式整合方式整合方式C C C、主要、主要、主要为单为单为单拷拷拷贝贝贝整合，整合，整合，1-10%1-10%1-10%为为为多拷多拷多拷贝贝贝整合整合整合 毕赤酵母系统方式表达载体毕赤酵母系统方式表达载体毕赤酵母系统方式表达载体毕赤酵母系统方式表达载体1 1〕〕〕〕AOX1AOX1位点插入位点插入位点插入位点插入宿主株宿主株:GS115、、KM71可插入位点：可插入位点： 5’AOX1 3’AOX1 TT转化子：转化子：GS115:His+Mut+KM71:His+Muts2 2〕〕〕〕His4His4位点插入位点插入位点插入位点插入转化子：转化子：GS115:His+Mut+KM71:His+Muts宿主株宿主株:GS115、、KM71可插入位点：可插入位点： 5’His4 3’His43 3〕〕〕〕 多基因插入事件〔串联整合〕多基因插入事件〔串联整合〕多基因插入事件〔串联整合〕多基因插入事件〔串联整合〕宿主株宿主株:GS115、、KM71可插入位点：可插入位点： 5’AOX1 3’AOX1 TT转化子：转化子：GS115:His+Mut+KM71:His+Muts4 4〕〕〕〕 基因取代〔基因取代〔基因取代〔基因取代〔GS115GS115，，，，AOX1+AOX1+〕〕〕〕转化子：转化子：His4+Muts汉森酵母系统的高拷贝整合型表达载体汉森酵母系统的高拷贝整合型表达载体汉森酵母系统的高拷贝整合型表达载体汉森酵母系统的高拷贝整合型表达载体高拷贝整合元件：高拷贝整合元件：A、高度反复序列：、高度反复序列：rDNA 提供多个整合位点提供多个整合位点B、缺陷型标志基因：、缺陷型标志基因：Leu2d 提高选择压力提高选择压力C、抗性标志；、抗性标志；neo 提高选择压力提高选择压力 甲醇酵母系统胞内表达载体甲醇酵母系统胞内表达载体甲醇酵母系统胞内表达载体甲醇酵母系统胞内表达载体表达表达表达载载载体体体类类类型型型需求带入需求带入ATG单位点单位点甲醇酵母系统胞内表达载体甲醇酵母系统胞内表达载体甲醇酵母系统胞内表达载体甲醇酵母系统胞内表达载体表达表达表达载载载体体体类类类型型型需求带入需求带入ATG多位点多位点甲醇酵母系统分泌表达载体甲醇酵母系统分泌表达载体甲醇酵母系统分泌表达载体甲醇酵母系统分泌表达载体信号肽：信号肽：PHO1甲醇酵母系统分泌表达载体甲醇酵母系统分泌表达载体甲醇酵母系统分泌表达载体甲醇酵母系统分泌表达载体信号信号肽：：MFα甲醇酵母系统分泌表达载体甲醇酵母系统分泌表达载体甲醇酵母系统分泌表达载体甲醇酵母系统分泌表达载体信号信号肽：：MFα标志：标志：Kan4 4、甲醇酵母系统高效表达影响要素与对策、甲醇酵母系统高效表达影响要素与对策、甲醇酵母系统高效表达影响要素与对策、甲醇酵母系统高效表达影响要素与对策载载载体体体稳稳稳定性定性定性基因基因基因剂剂剂量量量整合位点整合位点整合位点甲醇利用表型甲醇利用表型甲醇利用表型mRNA5’mRNA5’mRNA5’端端端ATATAT含量分泌信号含量分泌信号含量分泌信号表达表达表达产产产物物物稳稳稳定性定性定性1 1〕载体稳定性〕载体稳定性〕载体稳定性〕载体稳定性同拷同拷同拷贝贝贝数数数时时时，整合型的比自主复制型的表达程度高，整合型的比自主复制型的表达程度高，整合型的比自主复制型的表达程度高YRpYRpYRp型型型载载载体的体的体的稳稳稳定化：定化：定化： 选择选择选择———非非非选择选择选择培育交替数十代可得培育交替数十代可得培育交替数十代可得稳稳稳定的整合子，定的整合子，定的整合子，但但但费时费时费时，整合位点不确定。

整合位点不确定整合位点不确定采用采用采用YIpYIpYIp型型型载载载体体体: : : 更易更易更易实现实现实现整合、整合位点清楚整合、整合位点清楚整合、整合位点清楚2 2〕基因剂量〕基因剂量〕基因剂量〕基因剂量外源基因表达存在基因外源基因表达存在基因外源基因表达存在基因剂剂剂量效量效量效应应应挑挑挑选选选多拷多拷多拷贝贝贝整合子整合子整合子 载载载体引入体引入体引入G418/ZeocinG418/ZeocinG418/Zeocin抗性抗性抗性标标标志，整合子拷志，整合子拷志，整合子拷贝贝贝数数数与抗性成正相关，采用高与抗性成正相关，采用高与抗性成正相关，采用高G418/ZeocinG418/ZeocinG418/Zeocin抗性抗性抗性转转转化子体外串体外串体外串联联联多个表达盒，直接多个表达盒，直接多个表达盒，直接获获获多拷多拷多拷贝贝贝整合子整合子整合子采用采用采用YRpYRpYRp型型型载载载体体体稳稳稳定化技定化技定化技术获术获术获高拷高拷高拷贝贝贝整合子整合子整合子构建高拷构建高拷构建高拷贝贝贝整合型表达整合型表达整合型表达载载载体体体3 3〕整合位点〕整合位点〕整合位点〕整合位点外源基因表达盒整合于外源基因表达盒整合于外源基因表达盒整合于AOX/MOXAOX/MOXAOX/MOX或或或标标标志基因志基因志基因处处处，均，均，均可高效表达可高效表达可高效表达毕毕毕赤酵母中个赤酵母中个赤酵母中个别别别情况整合于情况整合于情况整合于His4His4His4位点的比位点的比位点的比AOX1AOX1AOX1位点位点位点的低的低的低4 4〕 〕 〕 〕甲醇利用表型甲醇利用表型甲醇利用表型甲醇利用表型 在分泌表达情况下，甲醇慢生长型更利于表达5 5〕 〕 〕 〕mRNA5’mRNA5’端端端端mRNA5’mRNA5’mRNA5’端非翻端非翻端非翻译译译区区区〔 〔 〔UTRUTRUTR〕 〕 〕的的的组组组成与成与成与长长长度度度应应应尽量与尽量与尽量与AOX1/MOXAOX1/MOXAOX1/MOX的一致的一致的一致应应应尽量防止在尽量防止在尽量防止在UTRUTRUTR区出区出区出现现现AUGAUGAUG和次和次和次级级级构造构造构造6 6〕基因序列的〕基因序列的ATAT含量含量 AT AT含量越高、越容易出现类似于终止子的构造含量越高、越容易出现类似于终止子的构造7 7〕分泌信号〕分泌信号〕分泌信号〕分泌信号分泌表达效率与所用分泌信号高度相关分泌表达效率与所用分泌信号高度相关分泌表达效率与所用分泌信号高度相关可采用可采用可采用酿酿酿酒酵母来源的酒酵母来源的酒酵母来源的MFαMFαMFα、、、PHOPHOPHO或或或SUCSUCSUC等的信号等的信号等的信号肽肽肽，或野生型信号，或野生型信号，或野生型信号肽肽肽，但适用性要比，但适用性要比，但适用性要比较较较分析。

分析8 8〕表达产物稳定性〕表达产物稳定性 分泌表达时，胞外蛋白酶是要影响要素分泌表达时，胞外蛋白酶是要影响要素降低培育基降低培育基pHpH值：蛋白酶在酸性条件下活性较低值：蛋白酶在酸性条件下活性较低培育基中添加蛋白水解产物：竞争性抑制培育基中添加蛋白水解产物：竞争性抑制采用蛋白酶缺陷宿主株：如采用蛋白酶缺陷宿主株：如P.pastoris SMD1168P.pastoris SMD1168。