SNP标记用于猪肉产品DNA溯源.doc

SNP标记用于猪肉产品DNA溯源吴潇吕贝贝王金斌蒋讳李鹏武国干唐雪明上海市农业科学院生物技术研究所釆用基于个体基因组DNA序列的差异而进行个体识別的DNA溯源技术，建立DNA 溯源系统对肉产品的质量安全进行控制在实验群体中（10个品种，233个个体） 检测了 33个新单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）标记 的遗传多样性，通过杂合度计算筛选出6个SNP标记可用于猪肉产品DNA溯源 进一步在屠宰场采样进行溯源模拟实验，结果表明筛选的18个SNP标记（6个 新SNP标记结合己有的12个SNP标记）能有效区分100头猪个体，随机抽取的 10个个体的组织样品都能通过基因型比对找到对应的个体本研究可为早日建 立猪肉产品的DNA溯源系统提供一定的技术参考关键词：猪肉产品溯源;DNA溯源技术;SNP标记;个体识别; R-mai1:qwuxiao@126. 基金：闵行区产学研合作计划项目（2016MH256）Development and Application of Pork Traceability System Based on SNP MarkersWU Xiao Ux Beibei WANG Jinbin JIANG Wei LI Pen WU Guogan TANG XuemingBiotechnology Research Institute, ShanghaiAcademy of Agricultural Sciences;Abstract：DNA traceability technology is based on DNA sequence differences between individuals for individual identification and the tracing of meat back to an individual animal. Establishing a DNA-based traceability system is important for the safety and quality of meat products. The genetic diversity of 33 new single nucleotide polymorphism (SNP) markers was detected in a test group (233 individuals，10 varieties) and 6 SNP markers, which are useful for pork product traceability, were obtained by heterozygosity calculation. A total of 18 SNP markers (6 new SNP markers in combination with 12 SNP markers) could effectively distinguish between 100 individuals collected from a local slaughter house in traceability simulation experiments. The corresponding individuals for tissue samples from 10 random individuals were found by genotype.This study has shown that SXP markers could be used for individual identification and pork traceability.Keyword：pork traceability; DNA traceability technology; SNP markers; individual identification;吴潇，吕贝贝，王金斌，等.SNP标记用于猪肉产品DNA溯源[J].食品科学， 2017，38(24) :278-282. D01:10. 7506/spkx1002-6630-201724045. . spkx. net .WU Xiao, mBeibei, WANG Jinbin, et al. Development and application of pork traceability system based on SNPmarkers[J]. Food Science, 2017, 38 (24) :278~282. (in Chinese with English abstract)D01:10. 7506/spkx1002-6630-201724045. . spkx. net. 猪肉作为我国最主要的动物蛋白来源，其安全问题受到普遍关注。

建立猪肉的溯 源体系，可以实现对猪肉制品的可追溯管理，从而为消费者提供产品有关的详 细信息，包括养殖、运输、屠宰、分割、销售等各个环节，大大加强了政府相关 部门对肉制品质量安全监管的力度[1-2]标签溯源技术因为操作简单、成本低，在我W得到广泛的应用但标签存在易混 淆、易脱落丢失，而且一旦猪肉产品间分割离幵胴体就无法再进一步追溯生物 体的DNA存在于其任何组织的细胞中，而i个体的DNA序列具冇特异性（同卵双 生除外）和稳定性，因此不受动物被分割的影响m，通过鉴别个体DNA特征能 够准确地识别动物个体，因此DNA技术被用于肉产品的溯源中DNA溯源技术需耍借助分子标记体现个体基因组序列的差异UL当前被认为是 最具应用潜力的分子标记是SNP标记，己在多个国家得到应用受饮食习惯影响， SNP标记主要在牛肉制品上成用较多，Heaton等采用SNP标记对美国中西部 17个州进行丫牛肉的追溯，在前期研究的基础上将SNP标记数目缩小到20个， 这组标记实现了从在售牛肉样品追溯到屠宰厂和农场M日本为了杜绝疯牛病 牛肉疫情的传播，Suekawa等［7］研究并使用SNP标记来筛选能区分円本本土黑 牛、荷斯坦牛与进口的澳大利亚牛肉、美国牛肉，从而确保了日木牛肉食品的安 全。

韩国为了支持本国牛肉产业和维护消费者的知情权，Cheonga等M研发一 组SNP标记用以区分韩国本地牛肉、进门牛肉和国产荷斯坦牛肉比利时的 Goffaux等M于就对猪基因的5’和3’非翻译区的SNP标记进行研允，获得一 组21个SNP标记，能有效区分比利时的主耍商品猪品种而我国猪肉产品溯源 还停留在耳•标等标签技术阶段在猪的长期育种工作中，己经积累了大量SNP标记，但只有至少满足下列条件 的标记才能用于溯源：1）变异度高，等位棊因频率较为接近;2）不同品种的等 位基因分布差异小;3）杂合度要大于或等于0. 3 ［2-3］由于现有SNP标记多为育种标记，跟某一类生产形状和关，因此往往集中分布 在某些染色体上，如1号染色体、12号染色体等，而另外部分染色体，如5号、 8号、14号染色体等则缺乏SNP标记因此为了满足对猪肉产品进行DNA溯源的 要求本研究率先进行了新SNP溯源标记的研究工作1材料与方法1.1材料实验样品釆自上海崇明富农猪场，伍括:皮特兰（P） 24头；申农（SN） 32头;大 申（DS） 31头;皮申（PS） 12头;长申（CS） 26头;杜申（Du S） 23头;皮大申 （PDS） 19头；长大申（CDS） 25头；杜大申（DDS） 7头；杜皮大申（DPDS） 31头。

溯源模拟实验的猪样品采自上海复兴屠宰场，随机采集100头猪个体的耳组织 样品和其中10头猪个体的组织样品（包括心脏、肝脏、冑部、肾脏、小肠、大 肠、尾巴、肌肉样品）1.2方法 1. 2. 1 DNA的提取采用酚/氯仿抽提法提取DNA，并稀释到25 ng/ P L, -20C保存提取方法参考 《分子克隆实验指南》1.2.2 PCR扩增和酶切对缺乏SNP标记的猪4、5、14、15、16号和18号染色体，利用NCBI数据库中 猪的基因组序列作为模板，用Primer 5. 0设计引物分离基因片段PCK扩增体 系为 20yL:其中 Taq DNA 聚合酶（5 U/ u L） 0. 20 u L, 10XPCR Buffer 2. OuL, d NTPs （2. 5 mmol/L） 0. 40 u L,引物 0.60 uL, DNA 模板（稀释后）3.0uL,去 离子蒸馏水13. 20 n L，退火温度依引物而定酶切体系1（T12ixL,其中扩增产 物3〜8uL，酶切Buffer 1.2uL,限制性内切酶5 U,反应6 h （各种酶的作用 温度不相同）酶切产物用1%~2%的琼脂糖电泳分析表 1 1 9 对引物序列及片段长度 Table ISequences and length of the 19 primers used in this study 1. 2. 3 SNP标记的筛选根据电泳图片记录个体的基因型，然后计算等位基因频率（P）公式如下:杂合度（heterozygosity, H）表示基因多样性，群体的杂合度表示某位点为杂 合子的概率，计算公式如下：式中水为i位点的等位基因频率;n为等位基因数。

根据引物的扩增效率、琼脂糖电泳的分辨率、等位基因频率和杂合度是否大于 0.3来进行SNP标记的筛选1.2.4溯源模拟实验将采自屠宰场的100头猪个体的耳组织样品按照广100依次编号，其中10头猪 只个体的样品按照组织编号，如丄（肝脏样品）、S （胃部样品）、H （心脏样 品）、K （肾脏）、T （尾巴样品）、T （大肠样品）和M （肌肉样品）对于每 一份样品，检测筛选的所有SNP标记的基因型，耳组织样品的基因型代表个体 的基因型，组织样品的基因型代表猪分割肉的基因型，按照酶切带型，1条带记 为1，出现2条带记为2, 3条带记为3，每一份样品所有SNP的基因型形成一个类似条形码的一串数字将10个组织样品的基因型数字条码和100头猪个体的 基因型数字条码进行比对2结果与分析2.1 SNP标记的挖掘通过克隆子测序和序列比对分析，发现了 33个可以用PCR-RELP方法识别的新 SNP位点SNP位点的碱基替代情况和内切酶如表2所示在实验群体中进行33个SNP标记的检测，记录每个位点的杂合子和纯合子的个 体数0然后根据公式计算基因频率和杂合度，苏中有6个SNP标记复合溯源标 记的要求，详见表36个SNP标记等位基因分布均衡，杂合度最大为0. 500 0, 最小为0.244 9。

杂合度低于0. 3的有两个，是SNP2和SNP3两个位点在杜大申 群体中的杂合度，这可能是因为杜大申样本数太少的原因，除此之外，这两个 位点除了杜大中群体中杂合度稍低于0.3，其他群体中的杂合度都大于0.3，而 iL杂合度平均值分别为0.401 9和0.413 9，均大于0.3，所以这两个位点也是 符合溯源标记要求的并且可以用于猪肉产品的溯源表 2 新 SNP 位点及内切酶 Table 2New SNP sites and the corresponding endonucleases 表3 6个新SNP在11个猪种中棊因频率及杂合度Table 3Gcnc frequencies and heterozygosity of 6 new SNPs in 11 pig breeds 2.2溯源模拟实验结果表4 1 2个己有的可用于溯源的SNP标记[10-19]Table 4Twelve existing SNP tags that can be used for traceability 为验证筛选的SN。