环保用酶制剂的生产与应用.ppt

环保用酶一、固定化酶什么是固定化酶？水溶性酶水溶性酶水不溶性载体水不溶性载体水不溶性酶水不溶性酶（固定化酶）（固定化酶）固定化技术固定化技术二． 固定化酶的优缺点• 多次使用 • 可以装塔连续反应•优点： 纯化简单• 提高产物质量• 应用范围广•缺点： 首次投入成本高• 大分子底物较困难•用于固定化的酶，起初采用的都是经提取和分离纯化后的酶•随着固定化技术的发展，也可采用含酶菌体或菌体碎片进行固定化，称为固定化菌体或固定化死细胞•1973年，日本首次成功应用固定化大肠杆菌菌体中的天门冬氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸固定化酶的方法 （一）（一）三大类方法：•吸附法•结合法•包埋法酶和细胞固定化示意图（1） 吸附法1、物理吸附：利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上•常用载体：•无机载体：氧化铝、活性碳、皂土、硅藻土、金属氧化物、硅胶一般吸附量<1mg蛋白/克吸附剂•有机载体：淀粉、白蛋白等一般吸附量几十毫克蛋白/克吸附剂•研究热点：大孔型合成树脂、陶瓷•优点： 吸附法制备固定化酶或细胞，操作简便，条件温和，不会引起酶变性失活载体廉价易得，而且可反复使用。

•缺点： 靠物理吸附作用，结合力较弱，酶与载体结合不牢而容易脱落（2）结合法•1 离子键结合法•2 共价键结合法☆1 离子键结合法•概念•常用载体:二乙氨乙基纤维素 ，二乙氨乙基葡聚糖凝胶•只需在一定pH值、温度和离子强度等条件下，将酶液与载体混合搅拌几个小时，或将酶液缓慢地流过处理好的离子交换柱，就可使酶结合在离子交换剂上，制备得到固定化酶缺点： 离子键结合力较弱，酶与载体不牢固； 在pH和离子强度等条件改变时，酶容易脱落所以，用此种酶时，要严格控制好pH、离子强度和温度等操作条件2 共价键结合法（1）概念 通过共价键将酶与载体结合的固定化方法2）常用载体：天然高分子、人工合成的高聚物、无机载体（3）可以形成共价键的基团： 游离氨基， 游离羧 基， 巯基， 咪唑基， 酚基， 羟基， 甲硫基， 吲哚基，二硫键•要使载体与酶形成共价键，必须首先使载体活化，即借助于某种方法，在载体上引进某一活泼基团然后此活泼基团再与酶分子上的某一基团反应，形成共价键•常用活化方法有： 重氮法、溴化氢法等A．重氮法 反应示意式如下（该方法需要载体具有芳香族氨基）•Tyr——酪氨酸B ．溴化氰法•本方法主要用溴化氰（CNBr）活化多糖类物质。

如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等.（3） 包埋法•包埋法分为网格型和微囊型•1．网格型•2．微囊型1．网格型•(1) 概念 将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微网格中，制成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法也称为凝胶包埋法•常用的凝胶有琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、明胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂等合成凝胶•天然凝胶在包埋时条件温和，操作简便，对酶活性影响少，但强度较差；•合成凝胶虽强度高，对温度、pH变化的耐受性强，但需在一定的条件下进行聚合反应，才能把酶包埋起来，易引起酶失活变性，应控制好包埋条件2．微囊型包埋法•是将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶由于固定化形成的酶小球直径一般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法 •仅适用于底物和产物都是小分子物质的酶的固定化各类固定化方法的特点比较: 比较项目吸附法结合法 包埋法物理吸附共价键结合离子键结合 制备难易易　难易 较难固定化程度弱　强中等 强活力回收率较高　低高 高载体再生可能　不可能可能 不可能费用低　高低 低底物专一性不变　可变不变 不变适用性酶源多较广广泛 小分子底物、药用酶•如何选择固定化方法？ 必须对酶的性质有所了解，根据实际条件和要求，选择适当方法。

① 酶的稳定性（热、pH、对某些化学试剂的敏感性）； ② 活性中心和必需基团的性质； ③ 酶的抑制剂和激活剂； ④ 载体的来源、价格、机械性能、载体的功能基团和交联度等（二）固定化酶反应条件的变化 酶经固定化后，其催化反应特征会发生变化，具体表现在以下几个方面：1、酶活力回收率变化 ——固定化酶所保留下来的酶的活力与游离酶在固定化之前的酶活力之比，也叫残存活力等 固定化后，酶活力往往下降2、底物专一性变化 对于作用与大分子底物的酶，当其固定化于水不溶性载体之后，往往由于空间障碍，而使酶对分子质量大的底物的催化活大大下降3、反应最适pH值变化 固定化后往往发生不同程度的变化4、反应最适温度 往往高于游离酶5、米氏常数Km的变化 Km值随载体性质变化 6、最大反应速度 基本相同，少数例外•与溶液酶相比，固定化酶总会在某些方面有所不同；•机理讨论目前还很肤浅二、酶反应器酶和固定化酶在体外进行催化反应时，都必需在一定的反应容器中进行，以便控制酶催化反应的各种条件和催化反应的速度用于酶进行催化反应的容器及其附属设备称为酶反应器。

用于酶进行催化反应的容器及其附属设备称为酶反应器酶反应器是用于完成酶促反应的核心装置它为酶催化反应提供合适合适的场所的场所和最佳的反应条件最佳的反应条件，以便在酶的催化下，使底物（原料）最大限度地转化成产物它处于酶催化应过程的中心地位，是连接原料和产物的桥梁酶催化反应过程示意图酶催化反应过程示意图酶催化反应过程示意图酶催化反应过程示意图过程调控过程调控生物反应器生物反应器 消消毒毒原料原料预处理预处理 产物分产物分离提纯离提纯 产产品品生物催化生物催化剂制备剂制备空气空气除菌除菌能量能量热量热量回本章目录理想的酶反应器的要求•生物反应器设计的主要目标：–使产品的质量最高，生产成本最低使产品的质量最高，生产成本最低•评价生物反应器的主要标准：–反应器生产能力的大小和产品质量的高低反应器生产能力的大小和产品质量的高低4) (4) 应具有最佳的无菌条件，否则，杂菌污染使反应器的生产应具有最佳的无菌条件，否则，杂菌污染使反应器的生产能力下降能力下降1) 所用生物催化剂应具有较高的比活和酶浓度（或细胞浓度）所用生物催化剂应具有较高的比活和酶浓度（或细胞浓度），才能得到较大的产品转化率才能得到较大的产品转化率。

2) (2) 能用电脑自动检测和调控，从而获得最佳的反应条件能用电脑自动检测和调控，从而获得最佳的反应条件3) (3) 应具有良好的传质和混合性能传质是指底物和产物在反应具有良好的传质和混合性能传质是指底物和产物在反应介质中的传递传质阻力是反应器速度限制的主要因素应介质中的传递传质阻力是反应器速度限制的主要因素(1)(1)间歇式酶反应器间歇式酶反应器•又称为批量反应器（Batch Reactor BSTRBSTR）、间歇式搅拌罐、搅拌式反应罐其特点是：底物与酶一次性投入反应器内，产物一次性取出；反应完成之后，固定化酶（细胞）用过滤法或超滤法回收，再转入下一批反应 •优点是：装置较简单，造价较低，传质阻力很小，反应能很迅速达到稳态•缺点是：操作麻烦，固定化酶经反复回收使用时，易失去活性，故在工业生产中，间歇式酶反应器很少用于固定化酶，但常用于游离酶(2) (2) 连续式酶反应器连续式酶反应器•又称为连续搅拌釜式反应器（Continuous Stirred Tank Reactor, CSTRCSTR）、连续式搅拌罐向反应器投入固定化酶和底物溶液，不断搅拌，反应达到平衡之后，再以恒定的流速连续流入底物溶液，同时，以相同流速输出反应液（含产物）。

•优点是：在理想状况下，混合良好，各部分组成相同，并与输出成分一致•缺点是：搅拌浆剪切力大，易打碎磨损固定化酶颗粒底物溶液进口 反应液出口 (3) (3) 填充床反应器填充床反应器•填充床反应器（Packed Reactor,PBR）,又称固定床反应器将固定化酶填充于反应器内，制成稳定的柱床，然后，通入底物溶液，在一定的反应条件下实现酶催化反应，以一定的流速，收集输出的转化液（含产物）•优点是：高效率、易操作、结构简单等，因而，PBR是目前工业生产及研究中应用最为普遍的反应器它适用于各种形状的固定化酶和不含固体颗粒、黏度不大的底物溶液，以及有产物抑制的转化反应•缺点是：传质系数和传热系数相对较低当底物溶度含固体颗粒或黏度很大时，不宜采用PBR(4) (4) 流化床反应器流化床反应器•流化床反应器（Fluidized Bed Reactor, FBR）•特点是：底物溶液以足够大的流速，从反应器底部向上通过固定化酶柱床时，便能使固定化酶颗粒始终处于流化状态•FBR可用于处理黏度较大和含有固体颗粒的底物溶度，同时，亦可用于需要供气体或排放气体的酶反应（即固、液、气三相反应）但因FBR混合均匀，故不适用于有产物抑制的酶反应。

(5) (5) 膜反应器膜反应器•膜反应器（membrane reactor, MRMR）是将酶催化反应与半透膜的分离作用组合在一起而成的反应器可以用于游离酶的催化反应，也可以用于固定化酶的催化反应•用于固定化酶催化反应的膜反应器是将酶固定在具有一定孔径的多孔薄膜中，而制成的一种生物反应器•膜反应器可以制成平板型、螺旋型、管型、中空纤维型、转盘型等多种形状常用的是中空纤维反应器连续搅拌罐连续搅拌罐连续搅拌罐连续搅拌罐————超滤膜反应器超滤膜反应器超滤膜反应器超滤膜反应器 简称简称CSTR-UFRCSTR-UFR在CSTRCSTR（连续式搅拌罐）出口处设置一个超滤器连续式搅拌罐）出口处设置一个超滤器可以将小分子产物与大分子酶和底物分开，有利于产物回收该反应可以将小分子产物与大分子酶和底物分开，有利于产物回收该反应器适用于颗粒较细的固定化酶、游离酶和细胞以及小分子产物与大分器适用于颗粒较细的固定化酶、游离酶和细胞以及小分子产物与大分子底物游离酶在膜反应器中进行催化反应时，底物溶液连续地进入反应器，酶在反应容器的溶液中与底物反应，反应后，酶与反应产物一起，进入膜分离器进行分离，小分子的产物透过超滤膜而排出，大分子的酶分子被截留，可以再循环使用。

7.4 酶反应器的选择和使用•影响酶反应器选择的因素很多，但一般可以从以影响酶反应器选择的因素很多，但一般可以从以下几个方面考虑：下几个方面考虑：–酶的形式(游离/固定化..)–固定化酶的形状–底物的物理性质–酶反应动力学性质–酶的稳定性–操作要求–反应器制造、控制成本通常颗粒状、片状、膜状或纤维状固定化酶固定化酶均可采用填充床反应器（PBR），而颗粒状、粉末状及片状固定化酶均可使用于连续式搅拌罐（CSTR），膜状固定化酶要用螺旋卷膜式反应器在应用游离酶游离酶进行催化反应时，酶与底物均溶解在反应溶液中，通过互相作用，进行催化反应可以选用搅拌罐式反应器、膜反应器、鼓泡式反应器、喷射式反应器等可溶性底物可溶性底物适用于所有的反应器难溶底物或者底物溶液呈胶体状者，适用于所有的反应器难溶底物或者底物溶液呈胶体状者，易堵塞柱床，可选用易堵塞柱床，可选用FBRFBR颗粒状底物溶液可适用于颗粒状底物溶液可适用于CSTRCSTR当反应过当反应过程需要控制温度、调节程需要控制温度、调节pHpH时，选用时，选用CSTRCSTR更为方便更为方便在反应器操作过程中，由于搅拌或液流的剪切作用，常会使酶从载体上脱落下来，或者由于磨损而使粒度变细，从而影响了固定化酶的操固定化酶的操作稳定性作稳定性。

酶反应器使用中应注意的问题酶反应器使用中应注意的问题•酶的稳定性对酶反应器的功效是很重要的酶的稳定性对酶反应器的功效是很重要的在操作过程中，有时需要用酸或碱来调节反应液PH如果局部的pH过高或过低，就会引起酶的失活，或者使底物和产物发生水解反应这时，可用加快搅拌已促使混合均匀•如果底物和产物在反应器中不够稳定的话，可以采用高浓度的酶，以减少底物和产物在反应器中的停留时间，从而减少损失•防止微生物污染微生物污染•酶反应器操作中，生产能力逐渐降低，主要原因是固定化酶活性降低固定化酶活性降低或损失或损失造成固定化酶活性损失的原因：–（1）酶本身的失活；–（2）酶从载体上脱落；–（3）载体的破碎或溶解。