嗜血杆菌分离培养基的评价与应用_陈东科.pdf

作者单位: 100730 卫生部北京医院检验科#论著#嗜血杆菌分离培养基的评价与应用陈东科 胡云建 张秀珍=摘要> 目的 选择合适的嗜血杆菌分离培养基提高嗜血杆菌分离率方法 将嗜血杆菌接种于 7种培养基上, 计算和比较 7种培养基上嗜血杆菌的平均生长指数( GI) ; 对 325 份呼吸道标本进行检测, 比较巧克力琼脂( BRchoc) 和加万古霉素巧克力琼脂(BRchoc -V) 的嗜血杆菌分离率结果 添加2% 鲜酵母浸液和 50% 鲜牛肉浸液的各种培养基, 较未加者的 GI 值明显增高; 兔血巧克力琼脂培养基较羊血巧克力琼脂培养基的 GI 值为高(P 嗜血杆菌; 培养基; 分离率Evaluation and applicatipn of media for isolation of haemophilus CHEN Dongke, HU Yunjian, ZHANG Xiuzhen. Department o f Laboratory Medicine, BeijingHospital, Beijing 100730, China=Abstract > Objective To select suitable media for increasing isolation rate of haemophilus. Methods Haemophilus was inoculated on seven types of media. The average growth index ( GI) of Haemophilus was calculated and Haemophilus was isolated from 325 specimens of the respiratory tract and its isolation rate was compared with that media of brchoc and brchoc -V agare. Results The GI of media with 2% fresh yeast infusion and 50% of meat infusion was higher thanthat of thosewith no yeast andmeat infusion. The GI ofHaemophilus on BRchoc was higher than that of the BSchoc( P Haemophilus; Medium; Isolation rate嗜血杆菌与许多感染性疾病有关[ 1], 但由该菌引起的感染发病率一直难以估计, 因为嗜血杆菌是 苛养性细菌, 其生长不仅需要 X、 V 因子, 而且受革兰阳性细菌生长的干扰, 分离培养极为困难。

因此,配制一种既操作简便又经济实用的嗜血杆菌分离培 养基, 用以提高嗜血杆菌分离率, 是临床诊断和治疗嗜血杆菌感染所急需的为了提高嗜血杆菌分离率, 作者对不同血源及配方的巧克力琼脂培养基进行了嗜血杆菌生长指数( growth index, GI) 的测定, 同 时进行了嗜血杆菌的分离率比较, 报告如下材料与方法一、 材料 1. 试剂: 脑心浸液( 干粉) 、 XV 因子( SR 158) 、VITEK -NHI 试卡及 X、 V 因子纸片购自生物梅里埃公司, 鲜酵母粉为市售( 东莞产) , 新鲜牛肉浸液、 1% 鲜酵母浸液[ 2]为本实验室自制, 脱纤维蛋白羊血、 兔血为外购 2. 试验菌株: 流感嗜血杆菌 ATCC 10211、 ATCC49247、 ATCC 49766 及金葡菌 ATCC 25923 为本实验 室菌库保存, 4 株副流感嗜血杆菌和 3 株溶血嗜血杆菌为临床分离菌株3. 培养基( 1) 基础培养基:A: 按厂家规定剂量 脑心浸液( 干粉) , 加 2% 琼脂粉和水, 调 pH7. 6, 置121e 15 min 高压灭菌; B: 脑心浸液( 干粉) , 加 2% 琼脂粉、 50% 鲜牛肉浸液、 50% 水, 调 pH 7. 6, 置121e 15 min 高压灭菌, 倾碟前无菌操作加入 2% 的 滤菌鲜酵母浸液( 补充 V 因子) 。

2) 应用培养基:Axv: 往A 中加入 X 因子( 氯化血红素 15 mgP L) 、 V 因子( 辅酶) 15 mgP L) ; Bxv: 往 B 中加入 X、 V 因子;A 羊血巧克力琼脂(ASchoc) : A 中加入5% 脱纤维蛋白羊血; B 羊血巧克力琼脂( BSchoc) : B 中加入 5%#28#中华检验医学杂志 2001 年1 月第 24 卷第 1期 Chin J Lab Med, January 2001, Vol 24, No. 1脱纤维蛋白羊血; A 兔血巧克力琼脂(ARchoc) : A 中加入 5% 脱纤维 蛋白兔 血; B 兔血巧 克力琼 脂( BRchoc) : B 中加入 5% 脱纤维蛋白兔血; B 兔血巧克力琼脂 -V( BRchoc -V) : BRchoc 中加入万古霉素(50 L gP ml) 上述培养基加血后置 85e 水浴 10 min 后倾制平板4. 标本来源: 325份标本取自 6~ 8 岁健康儿童的咽部分泌物, 男、 女比例为 162 P 163, 取材当日无流感流行二、 方法1. GI 值测定: 取经 18 h 培养的嗜血杆菌( n= 10) 单个菌落于 1 ml 脑心浸液中, 用脑心浸液进行1B10连续稀释, 取各稀释度菌液 100 Ll 均匀接种在各种分离培养基上, 于 8% CO2孵箱中 35e 孵育 24h, 计数少于 10 个菌落平板上的菌落数, 并用游标卡尺量出菌落直径, 求其均值( mm) , 再乘以此最高稀释度的对数即得 GI 值[ 3]。

2. 嗜血杆菌分离率比较: 以兔血巧克力琼脂( BRchoc) 和加万古霉素( 50 L gPml) 的兔血巧克力琼脂( BRchoc -V) 为分离培养基, 对 325 份标本进行嗜血杆菌的分离培养, 按规程进行操作[ 4], 分离菌株用 VITEK -NHI 试卡鉴定到种3. 统计分析: 用 t 检验比较流感嗜血杆菌在各种培养基上的GI 差异; 用 V2检验比较两种培养基对嗜血杆菌的分离率结果1. 不同营养的培养基 GI 值比较: 表 1 数据显示, 培养基中加与不加鲜酵母浸液和鲜牛肉浸液, 生长指数差异有显著性( P< 01001) B优于A表 1 不同营养培养基上的 GI 值比较( n= 10)培养基GI( €x ? s)t( P 值)Axv4. 185? 1. 161 Bxv6. 286? 1. 57210. 15( < 0. 001) ASchoc2. 259? 0. 734 BSchoc5. 352? 1. 53810. 56( < 0. 001) ARchoc4. 166? 1. 345 BRchoc7. 006? 1. 58113. 58( < 0. 001)2. 不同血源巧克力培养基 GI 值比较: 嗜血杆菌在不同血源巧克力培养基的 GI 值结果如表2 所示,BRchoc 培养基 GI 值显著高于 Bxv, BSchoc GI 值显著低于 Bxv( P< 0. 001) 。

3. 两种培养基嗜血杆菌的分离率: 325份标表 2 嗜血杆菌在不同血源巧克力培养基的GI 值比较( n= 10)培养基GI( €x ? s)t( P 值)Bxv 6.286? 1. 572BRchoc7.006? 1. 5815. 39( < 0.001)BSchoc5.352? 1. 5386. 64( < 0.001)本在BRchoc -V培养基分离251株嗜血杆菌, 分离率为77. 2% ; 而在 BRchoc 培养基上仅分离到嗜血杆菌104株, 分离率为 32. 0% , 嗜血杆菌在两种培养基上 的分离率差异有显著性( P< 0. 001) , 分离结果见表3表 3 325份标本中嗜血杆菌分离率比较菌种BRchoc分离株数( % )BRchoc -V分离株数( % )V2P 值流感嗜血杆菌3( 0. 9)17( 5. 2)12. 07 < 0. 001 副流感嗜血杆菌44(13. 5)136( 51. 5)88. 17 < 0. 001副溶血嗜血杆菌54(16. 6)95( 29. 2)39. 09 < 0. 001溶血嗜血杆菌3( 0. 9)3( 0. 9)))合计104(32. 0)251( 77. 2)141.24 < 0. 001讨论嗜血杆菌是专性寄生的苛养性细菌, 其生长需要X、 V 因子或两者之一, 最适生长温度为 35e ~37e , 在 pH7. 6 条件下生长最好[ 5]。

7 种培养基嗜 血杆菌的 GI 值比较结果显示: 嗜血杆菌在兔血巧克力琼脂培养基上生长好于羊血巧克力琼脂培养基( P< 0. 001) ; 在培养基中加入营养物质后( 2% 的鲜酵母浸液和 50%鲜牛肉浸液) , 菌落直径明显增大, GI 值显著提高( P< 0. 001) 嗜血杆菌主要寄生在呼吸道, 是引起下呼吸道感染的主要病原菌[ 6]呼吸道标本中的嗜血杆菌在初代培养时, 受到革兰阳性细菌的抑制, 菌落细小不 易与其他杂菌相区别, 这是造成嗜血杆菌分离率低的直接原因, 当在培养基中加入万古霉素后, 抑制了革兰阳性细菌的生长, 增加了对嗜血杆菌的选择性,嗜血杆菌在加万古霉素的培养基上, 菌落生长较大, 极易识别, 从而提高了嗜血杆菌的分离率325 名儿童咽拭子的分离结果表明, 加万古霉素( 50 L gPml) 的兔血巧克力琼脂培养基对嗜血杆菌的分离率为 77. 2% , 而未加万古霉素兔血巧克力琼脂培养基 的分离率为 32% , 两者差异极为显著( P< 0. 001) ,两种培养基对流感嗜血杆菌、 副流感嗜血杆菌和副溶血嗜血杆菌的分离率差 异均有显著性 ( P < 01001) 。

29#中华检验医学杂志 2001 年 1 月第 24 卷第 1 期 Chin J Lab Med, January 2001, Vol 24, No. 1总之, 嗜血杆菌分离培养基以 5% 兔血巧克力琼脂最好( 脑心琼脂虽好, 但 X、 V 因子需进口, 菌落辨认较难) , 如兔血来源困难也可用羊血代替, 但需 加入一定的营养物质为提高嗜血杆菌分离率, 应在培养基中加入 50 L gP ml 的万古霉素( 或其他革兰阳性细菌抑制剂) 如 X、 V 因子纸片来源困难, 嗜血杆菌 X、 V 因子需求试验可用金黄色葡萄球菌斑 点法( 即卫星试验) 代替[ 7]参考文献1 Burman LA, Trollfors B, Anderson B, et al. Diagnosis of pneumonia by cultures,bacterial and viral antigen detection serology with special reference to antibodies against pneumonia antigens. J Infect Dis, 1991, 163: 1087.2 李仲兴, 郑家齐, 李家宏, 主编. 诊断细菌学. 香港: 黄河文化出 版社, 1992. 440. 3 Rennin R, Gordon T, Yaschuk Y,et al. Laboratory and clinical eveluatioas of media for the primary isolation of Haemophilus species. J Clin Microbiol, 1992, 30: 1917. 4 卫生部医政司. 全国临床检验操作规程. 第 2 版. 南京: 东南大 学出版社, 1997.347. 5 吴丽华, 徐培元, 周第. 流感嗜血杆菌培养基及培养条件的研究. 中华医学。