双缩脲法测定面粉中蛋白质的含量.doc

双缩脲法测定小麦面粉中蛋白质的含量实验八实验八 双缩脲法测定面粉中蛋白质的含量双缩脲法测定面粉中蛋白质的含量一、目的要求1．学习双缩脲法的基本原理及操作2．通过实验学会制作标准曲线二、实验原理：双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经 180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物在强碱性溶液中，双缩脲与 CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应在一定的浓度范围内，紫色络合物颜色深浅与蛋白质含量呈线性关系（即：颜色的深浅与蛋白质浓度成正比）而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可在 540nm 处比色用来测定蛋白质含量测定范围为 1－10mg 蛋白质/ml干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris 缓冲液和某些氨基酸等此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少主要的缺点是灵敏度差因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定三、操作方法：1．标准曲线的制作酪蛋白：10mg/ml（如果用干酪素来配制则需用 0.05M NaOH 做溶剂，也可以用酪蛋白酸水解物直接配制。

）管号123456 酪蛋白(ml)00.40.81.21.62 蒸馏水(ml)21.61.20.80.40 双缩脲试剂(ml)333333 混匀，放置 30 分钟 A5400 计算出各管浓度（计算出各管浓度，再做标准曲线，那么最后计算的公式中就不用除 以 6 了，这么做好理解些 ）混匀，放置 30 分钟后，在 540nm 处以 1 号管调 0 点，测定各管吸光度，以吸光度（OD 值）为纵坐标，蛋白质浓度（酪蛋白的毫克数）为横坐标绘制双缩脲法测定小麦面粉中蛋白质的含量标准曲线四、样品处理1．0.25g 小麦面粉＋0.5ml 四氯化碳＋25ml 双缩脲试剂（四氯化碳为有机溶剂，在这里作为分散剂，使面粉不成团 ） ；2．加塞，在摇床上振摇 30 分钟，使之充分混匀、反应，然后于实验台上静置10 分钟；3．离心，4000rPm，离心 15 分钟；4．取上清比色：OD 540 nm；（在用滴管取上清时要轻、缓，避免沉淀物上浮对照管是以介质溶液调零，即去除样品后的溶剂，在这里为 0.5ml 四氯化碳＋25ml 双缩脲试剂 ）五、计算OD 值所对应的蛋白质毫克数×25.5/6/200 ×100％ 即面粉中酪蛋白的百分含量。

『双缩脲试剂』：取 1.5g 硫酸铜（CuSO4·5H2O)和 6.0g 酒石酸钾钠（NaKC4H4O6·4H2O）溶于500ml蒸馏水中,搅拌加入300ml的10％NaOH（或KOH）（可另加 lg KI以防止Cu2+自动还原成一价氧化亚铜沉淀），用水稀释至l000ml此试剂存于棕色瓶中避光可长期保，若有黑色沉淀产生需重配注意事项】标准曲线绘制和样品测定应使用同一台分光光度计注意事项 （1）本法应用范围，因不同书籍报道，数值不一本实验方法测定范围 1—10mg 蛋白质 /ml （2）须于显色后 30min 内比色测定30min 后，可有雾状沉淀发生各管由显色到比色 的时间应尽可能一致 （3）有大量脂肪性物质同时存在时，会产生混浊的反应混合物，这时可用乙醇或石油醚 使溶液澄清后离心，取上清液再测定。