分子生物学实验步骤总结计划超全.doc

分子生物学实验步骤总结计划超全分子生物学实验步骤总结超全————————————————————————————————作者:————————————————————————————————日期:?一目的基因的获取细菌基因组DNA的提取（一）仪器1）台式高速离心计2）恒温水浴箱3）枪式移液器4）灭菌的EP管和Tip头（二）试剂1）溶液1:25%蔗糖50ｍmoｌ／LTrｉs-Hcl,ｐH8.０50mmol/ＬEＤTA,ｐH8．０5０0ug／ml溶菌酶(现用现配）1０0ug/mlRNaｓe２）溶液Ⅱ:１00mｍｏl/LTrｉs-Hcl,pＨ8.０1%SDS４00ug／ml蛋白酶K3）酚:氯仿:异戊醇（25:2４:1)4）氯仿:异戊醇（24：１）5）3moｌ/LNaＡｃ(pH5.2)6）异丙醇或无水乙醇7）70％乙醇８)TＥ缓冲液： 10mmol/ＬＴris-Hｃl，pH８.０1mmol/LEDTＡ，pH８．0(三)实验步骤1）5ｍL细菌留宿培育,5000ｒｐm离心10分钟，去上清液2）将菌体细胞悬于250uL溶液１中，3７°C水浴保温留宿3）加250ｕＬ溶液Ⅱ，55°C水浴保温4小时。

4）加倍体积的酚／氯仿／异戊醇(25:24：1)，轻轻混匀，于1４０00rpm离心１0分钟，转移水相至新的Ｅp管，重复步骤4一次5）向转移的水相中加入0,９倍体积的氯仿/异戊醇（2４:1)，轻轻混匀,于１４00０rpm离心1０分钟,转移水相至新的Ep管,重复步骤5一次6）向转移的水相中加入０．1倍体积的3ｍol/ＬNaAｃ和倍体积的异丙醇（或2．5倍体积的无水乙醇）,冰上搁置３0分钟7）１4000rpm离心20分钟,弃上清，用ｍL70％乙醇清洗积淀一次,弃上清，积淀于室温干燥8）将DＮＡ积淀溶解于１5uｌTＥ缓冲液中,－20°C保留9）进行ＤNA含量和纯度检测，琼脂糖凝胶电泳判定植物DNA的SDS提取法:(一)试验试剂：1）研磨缓冲液：称取５９.6３gNaCｌ，13.２5g柠檬酸三钠，37．２gEDTA-Na分别溶解后归并为一,用０.2mｏl/Ｌ的NａＯＨ调至ｐＨ7．0,并定容至1000mｌ２）１0ＳＳＣ溶液：称取８7．66gＮaＣl和4４．1２ｇ柠檬酸三钠，分别溶解，一同定容至1000ml3）１SSC溶液:用10SSC溶液稀释10倍4）0．1ＳSC溶液：用1ＳSC溶液稀释1０倍5）Rnase溶液:用４mol／ＬＮaCl溶液配制成25mg/mｌ的酶液，用1mol/LHCl，ｐＨ至5.０,使用前经80℃水浴办理5ｍｉn（以损坏可能存在的Dｎasｅ）。

氯仿－异戊醇：按24ｍl氯仿和1ml异戊醇混淆7)5mｏl／L高氯酸钠溶液：称取ＮaClO4．H2O７，先加入少许蒸馏水溶解再容至10０ｍlＳDS(十二烷基硫酸钠）化学试剂的重结晶：将SDS放入无水酒精中达到饱和为止,而后在70～80℃的水浴中溶解,趁热过滤,冷却以后立刻滤液放入冰箱,待结晶出现再置室温下凉干待用1mol/LHCl０.２mol/LNａOH1１）二苯胺乙醛试剂：ｇ二苯胺溶于10０ml冰醋酸中，增添浓硫酸，装入棕色瓶，储存暗处,使用时加0.１mｌ乙醛液[浓乙醛：H2Ｏ=１：５0(V／V）］１２)1.０ｍol／L高酸溶液(HClO4)ｏｌ／ＬＮaOH4)DＮA标准液:取标准DＮA25mｇ溶于少许ｏl/ＬNaOH中，再用0．05mol/LＮaOH定容至２5ｍｌ,后用移溶管汲取此液5ｍl至50ｍｌ容量瓶中,加5．0ml１mol／LＨＣlO4，混淆冷却后用ｍol／ＬHClＯ4定容至刻度，则得100μｇ/ｍl的标准溶液二)实验步骤:称取植物幼嫩组织10ｇ剪碎置研钵中，加10ml预冷研磨缓冲液并加入左右的SDS，置冰浴上研磨成糊状将匀浆无损转入25mｌ刻度试管中加入等体积的氯仿-异戊醇混淆液，加上塞子,激烈振荡3０ｓ,转入离心管，静置片晌以脱除组织蛋白质。

以4000ｒpm离心５min离心形成三层，当心地汲取上层清液至刻度试管中,弃去中间层的细胞碎片、变性蛋白质及基层的氯仿将试管置72℃水浴中保温3min(不超出４mｉn)，以灭活组织的ＤNA酶,而后快速拿出试管置冰水浴中冷却到室温,加５mｏl/L高氯酸钠溶液［提取液：高氯酸钠溶液＝4：1(V／V)］，使溶液中高氯酸钠的最后浓度为１mol/Ｌ再次加入等体积氯仿-异戊醇混淆液至大试管中，振荡1miｎ,静置后在室温下离心(400０rpm）5ｍｉn，取上清液置小烧杯中)用滴管吸95％的预冷乙醇，慢慢地加入烧杯中上清液的表面上，直至乙醇的体积为上清液的两倍，用玻璃棒轻轻搅动此时核酸快速以纤维状积淀环绕在玻璃棒上而后加入ｍl左右的1０ＳSC，使最后浓度为1SSC8）重复第6步骤和第7步骤即获取DNA的粗制品加入已办理的Rnase溶液，使其最后的作用浓度为5０~70μg/ml，并在３7℃水浴中保温３0min,以除掉RNA0)加入等体积的氯仿－异戊醇混淆液，在三角瓶中振荡１min，再除掉残留蛋白质及所加Rnａｓe蛋白,室温下以４00０rpm离心5min,采集上层水溶液11) 再按６、7步骤办理即可获取纯化的ＤＮA液。

二、PCR扩增目的基因(一)器械微量移液器灭菌的Tip头、ＰCR管PCR扩增仪目的DNＡ（ＤNA模板)dNＴP混淆物引物对Taｐ酶PCR扩增试剂盒（二)试剂1)10×PCR缓冲液(含Trｉs-ＨCl100mmｏl/Ｌ;ＭgCｌ215mmol/Ｌ、KCl500mmol/L,pH8．3,0．１%明胶)2)脱氧核苷三磷酸dNＴPs：配成10mＭ——dAＴP,ｄＴTP，dGＴP，dCTＰ各10mM,用NａOH溶液调理至ｐＨ８.3氯仿-异戊醇:配成24:１的比率，室温避光保留酚：氯仿：异戊醇=25：2４:1)３MNaAｃ、ddH2O6)无水乙醇:7０%乙醇７)TE缓冲液（三）实验步骤１)在ｌ薄壁反响管中加入以下成份:（混匀)ddH2O:补至终体积(2５μl）1０×PCR缓冲液1/１0整体积.0mＭdNTPs1μl２Ｕ/μlTaｑ DNA聚合酶0.５μl引物混淆液(１0pｍoｌ/μl/引物)１μlDNA模板０.6μl混匀后,在台式离心计上刹时离心１0秒在设定好的PCＲ仪上反响９5°C,5min;95°C，1miｎ;56°C,１min；72°C,2mｉn反响３０轮3）反响结束后，将反响管在72°C充足延长10分钟，再将反响管冷却至４°C。

取一部分反应液进行琼脂糖凝胶电泳(实验三）,确认能否有目的的PＣR产物假如PＣR产物纯度较低或反响液中含有连结反响阻挡物,能够经过纯化获取改良纯化持续４）—6)４）转至1．5ml离心管，向管中加２5μl酚，2５μｌ氯仿－异戊醇混匀，离心10000rpm，30秒5）汲取上层液,转至另一已加5μl3MＮaAc的ｌ的离心管，加150μl无水乙醇,-２0°C留宿6）离心10000rpm,1０分钟，弃上清,加％乙醇，１00００rpｍ离心,5分钟弃上清，烤箱中干（60°C)，溶于20μlTE四）技术重点PＣR各组份的配制与加样量要特别注意１)引物浓度：１0 ｐmol足够30个循环，浓度太高致使与模板非特异联合加强,扩增非特异片段增加，浓度太低则扩增效率低2)引物的配制：厂家供给的引物一般是干粉状态并注明OＤ值,1OD约含33μg开盖前先将干粉离心至管底,加双蒸水至浓度２μg/μl，再取部分稀释至10pmoｌ／μl引物-4，n是引物的碱基数浓度计算公式:1ｐｍol=(3．３×10μg)×ｎ（3)Mg2＋：使用浓度一般在１.５mM,要求模板不含高浓度EDＴA和诸如硫酸基团类的负电荷基团，２+Mg浓度高升可致使错配率高升和非特异性扩增。

模板ＤNA：浓度不行过高，质粒DNA2０ｎg即可，若需第二次扩增，可将第一次扩增产物稀释1000－10000倍作为模板使用5)TａqDNA聚合酶:一般用量5U/100μl酶量过大易致使扩增非特异序列，Taｑ酶拥有尾端转移酶活性,常在3’端加A扩增轮数与退火温度６扩增轮数：一般３0轮之内便可使模板扩增1０倍，超出30轮，错配率高升退火温度计算公式：Ｔm值=（GC×4+AT×2）–4三、琼脂糖凝胶电泳的检测(一)仪器1）琼脂糖凝胶电泳系统(天平、锥形瓶、量筒、微波炉、凝胶板、梳子、枪式移液器、灭菌Tｉp头、水平电泳槽、电泳仪）2）凝胶成像仪(二)试剂及资料目的DＮA、琼脂糖、蔗糖、溴酚蓝、硼酸、Tris、EDＴA、EＢ、DNA纯化试剂盒1)TＡE电泳缓冲液浓储藏液50×:242gＴriｓ;57.１ml冰乙酸;10０ｍｍol/ＬEDTA（PH8.０)定容至一升使用液1×:4.８4gTrｉs；ｍl冰乙酸；2ｍmｏｌ/LEDTA(PH8.0)定容至一升样本液１０×缓冲液:60%蔗糖;0．４%溴酚蓝(三)实验步骤１）将有机玻璃内槽洗净、晾干 ,搁置于水平制胶器中,插好梳子,在梳子底部与胶槽之间应保持几毫米的空隙。

2）0.8%琼脂凝胶板的配制：取０.6g琼脂糖加8０mlTAE(1×)，20ml水,微波炉加热消融３分钟,将其冷却至５5°C-６5°C,加入ＥＢ储藏液1ul,当心混匀,迟缓倒入制胶槽中依据目的基因的大小选择琼脂糖凝胶浓度)3）充足凝结后从制胶槽中卸掉凝胶板,放入电泳槽，加入TＡE（1×），使其液面略高于琼脂糖板，拨出样品梳)ＤＮＡ样品依据１0:1的比率加入样本液,在腊面纸上混匀，用移液枪加样于琼脂糖板的样品孔中同时另取一个DNA分子量标准上样于另同样品孔，在同一凝胶板长进行电泳5）接通电泳槽与电泳仪的电源,保持稳压1-5V/ｃm（依据两极之间距离计算)，电泳时间依据溴酚蓝指示剂迁徙的地点来判断,当挪动到距凝胶前沿1-2ｃm出停止电泳６）剥胶并在凝胶成像仪察看结果四）技术重点选择琼脂糖凝胶浓度取决于所判定ＤNA的大小,小片段DNA应用高浓度凝胶，大片段则用低浓度凝胶，在１%的琼脂糖凝胶中溴酚蓝的泳动速度与５00bp的双链线状ＤNA一致不一样浓度琼脂糖凝胶及其可分别的线性ＤＮA大小范围见下表1表１不一样浓度琼脂糖凝胶及其分别线性DNA分子的有效分别DＮA的有效范围范围凝胶浓度(%)（kb)60~50．620~1０.810～０.8１.01．2３～２.0２～０.12)电泳中注意防备凝胶发热。

3）将电泳仪置稳压档，电压设置小于 5Ｖ/cm(电极间的最小道径)跟着电压的增添,琼脂糖凝胶的有效分别范围减小４)溴化乙锭有激烈的致癌作用，操作时注意防备四、目的DNA的回收纯化(一）仪器琼脂糖凝胶电泳系统２)凝胶成像仪3）离心计单面刀片恒温水浴锅(二)试剂１) DＮＡ回收试剂盒2）5０×TAE3）ddＨ２O(三)实验步骤１）在紫外灯下切分含Ｄ NA的琼脂糖块，尽可能除掉剩余的琼脂糖 .放入1.５ml离心管中按每1０0mｇ琼脂糖加入300—６00μl溶胶液的比率加入溶胶液（本实验加500ul),置5５℃水浴10分钟,使琼脂糖块完整熔解，时期每2分钟颠例混匀一次促溶将熔解后的琼脂糖液移入吸附柱，1２000rｐｍ室温离心1分钟,倒掉采集管中的液体.再将吸附柱放入同一个采集管中4）在吸附杜中加入 500uI漂洗液，室温静置 1分钟后，１20０0rpｍ室温离心3０秒,倒掉采集管中的液体,将吸附柱放入同一个采集管中)再在吸附柱中加入５０0uI漂洗液，1200０ｒpm室温离心15秒,倒掉采集管中的液体,将吸附柱放入同一个采集管中1２00０ｒｐm室温空离心1分钟)将吸附柱放入一个洁净的1．5ml的。