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武汉生物工程学院学士学位论文学士学位论文烟色曲霉原生质体制备与紫外诱变题 目 类 别 毕业论文 系 别 生物工程系 专 业 班 级 08014101 学 生 姓 名 张尚昆 指 导 老 师 周念波 辅 导 老 师 黄 英 起 止 时 间 2011年10月至2012年5月 论文提交时间 2012年5月 二零一二年五月论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行研究工作所取得的成果除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意本声明的法律结果由本人承担学位论文作者签名： 年 月 日目录摘 要 Ⅳ关键词 ⅣAbstract ⅤKey words Ⅴ前言 11.1 材料 41.1.1 样品 41.1.2 实验试剂 41.1.3 酶 41.1.4 仪器与设备 41.1.5 培养基 41.2 实验方法 51.2.1 筛选育种过程 51.2.2 出发菌株烟色曲霉分解壳聚糖能力检测 51.2.3 酶液的配制 51.2.4 孢子悬液的制备 51.2.5 制备原生质体 51.2.6 原生质体的紫外诱变及再生 51.2.7 高产菌株的检出 52 结果和分析 62.1 烟色曲霉原生质体制备培养条件优化 62.1.1菌龄对原生质体产率的影响 62.1.2 酶液pH对原生质体产率的影响 62.1.3 酶作用温度对原生质体产率的影响 72.1.4 酶作用时间对原生质体产率的影响 82.2 原生质体紫外照射剂量的确定 92.3 紫外诱变结果 93 结论 10参考文献 11致 谢 12烟色曲霉原生质体制备与紫外诱变摘 要本实验以烟色曲霉（Monacus fulginosus）为出发菌株,用混合酶制取原生质体并对原生质体形成条件进行探讨,并进行紫外诱变选育。

采用18 h菌龄的菌丝体,使用pH为5.0的蜗牛酶（5mg/ml）+纤维素酶（5 mg/ml）复合酶液，30 ℃下酶解2.5 h,在该条件下原生质体浓度可达6.5×106个/mL,再生率为6.3%在最佳紫外线照射时间90 s下,突变株经筛选,得到一株降解壳聚糖的酶活显著提高、遗传性能稳定的诱变株其酶活比出发菌株提高了1.23倍关键词烟色曲霉；壳聚糖酶；原生质体；紫外诱变Protoplast Preparation and Breeding of Higher Esterifying Enzyme Activit Mutants by Protoplast Mutagenesis of Ultraviolet Irradiation of Monacus fulginosus Abstract Using Monacus fulginosus as the original strain,Studied on the preparation and regeneration conditions of protoplasts by mutagenesis of ultraviolet irradiation。

The results showed that treated 18h culture of Monascus ruber with 5mg/ml snail enzyme and 5mg/ml Cellulose enzyme whose pH is 5.0, the enzymolysis time was 2.5 hours, the enzymolysis temperature was 30 ℃, the protoplasts could reach 6.5×106 unit/mL, and the regeneration rate reached up to 6.3%Under UV irradiation time in the best case for the 90s, After initially sieving and duplicate sieves,the mutagenesis strain which own increasing enzyme activity and transmissibility was obtainedIts esterifying enzyme content is 1.23 times higher than the original strain。

Key wordsMonacus fulginosus; Chitosan enzymes; protoplast; ultraviolet mutagenesisII前言 原生质体是指细胞壁被酶水解剥离后，剩下由原生质膜包围的原生质部分原生质体通常是由对数生长期的细胞制备而来的，代谢旺盛复制频繁生活力强对诱变剂的敏感性也强，诱变后易于形成单菌落而便于筛选；同时，原生质体还具有细胞壁再生能力，保持了细胞的全能性，可以按照常规的细胞诱变方式对其进行诱变，从而提高突变株的变异幅度，诱变效果更为理想[1]1研究背景与意义自Buchman和Bonner在1959年首次报道利用酶解破壁方法从粗糙脉孢霉菌丝体释放原生质体以后，在其他各种真菌的原生质体制备和再生的研究陆续开展，极大丰富了人们对真菌细胞外表和其生理功能的知识，尤其对于20世纪70年代中期兴起的原生质体融合遗传育种手段在丝状真菌的应用起到了启动作用[2]对于烟色曲霉的原生质体制备、再生以及原生质体诱变育种技术的研究也日益增多但是自然筛选的烟色曲霉产酶水平一般较低，无商业开发价值，而诱变育种是一种简便易行而且快速的选育方法由于各种诱变剂对微生物的作用位点和方式不尽相同， 因此，反复使用同一诱变因子会出现钝化现象可能引起微生物的回复突变，这就要求在烟色曲霉进行诱变育种时要尽量选用新的诱变因子，才会有较大可能性取得成功。

原生质体由于去除外壁障碍，对各种诱变剂敏感性较强，往往正突变率高，因而利用原生质体直接诱变经过多种诱变剂处理过的钝化株，是较有意义的诱变方法 基于上述原因，人们采取各种手段以获得稳定性产酶菌株潘力等人2006年对酱油曲霉孢子原生质体的制备条件进行优化，得到酱油曲霉BI孢子原生质体的制备条件为：选取培养5 d、绿色孢子开始旺盛生长的新鲜斜面培养物制备孢子悬浮液，采用25 mmol/ Lβ-巯基乙醇 + 5 mmol/L Na2 EDTA 体系预处理20 min，酶解条件是1%溶菌酶 + 1%蜗牛酶 + 1%纤维素酶，山梨醇渗透压稳定剂(0.6 mol/ L，pH 6.88)，酶解温度33 ℃，酶解5 h，再生培养基为0.6 mol/L NaCl 高渗透压豆汁培养基，涂布法再生选用致死率为99.95%以上的诱变剂量对制备的原生质体进行紫外诱变处理，最终从230余株突变株中筛选得到7株酶活有较大提高的菌株系列U，遗传稳定性试验证明它们均具有高水平且稳定的中性蛋白酶酶活[3]王燕2007年对双亲灭活米曲霉原生质体融合中原生质体制备的研究得出原生质体制备最佳条件为：最佳破壁酶为纤维素酶、溶壁酶、蜗牛酶3种酶混合，混合浓度比为5:3:1；菌丝培养15 h，酶解时加入DTT 3 mmol/L；酶解2.5 h，0.8 mol/L NaCl作为渗稳剂，制备所得原生质体融合后融合率达到3.31%[4]。

李萍等于2000年对黑曲霉原生质体进行紫外、LiCl复合诱变，获得了1株产β-葡萄糖甘酶活较高的菌株，其酶活有出发菌株的10 U/mL提高到14.7 U/mL[2]郭鲁宏等2000年以黑曲霉（Aspergillus niger）No.13为出发菌株，经紫外线处理，获得1株制备原生质体的起始菌，该菌株单宁酶活性比No.13提高55%；并对制备原生质体的条件进行了研究，在优化方案基础上，紫外诱变原生质体，诱变菌株经筛选，得到1株产单宁酶活是出发菌株的2倍的菌株[2]彭益强等2002年将2株黑曲霉菌株（I、II）在诱导产植酸酶的条件下分别制备成原生质体，并考察其原生质形成及再生，经紫外诱变后，发现涂平板的黑曲霉（II）原生质体在再生过程中菌落形态发生明显变化考查突变菌种的植酸酶酶活，筛选到其中1个变异株比原始黑曲霉（II）亲本株的植酸酶酶活提高了2.2倍[2]2曲霉原生质体的性质2.1 烟色曲霉原生质体Weibull[13]等于1953年首先提出原生质体概念用水解酶将细胞壁水解剥离，剩下由原生质体膜包围着的原生质体部分称为原生质体（protoplast）其形状随不同菌类而异原生体基本保持原细胞结构、活性和功能，只是因为去掉了细胞壁，对渗透压和外界环境特别敏感。

为制备原生质体，必须有效地除去细胞外的细胞壁去壁的方法有机械法、非酶分离法和酶法实际工作中绝大多数采用酶法，时间短，效果好[2]2.2 原生质体的生物学特性原生质体与完整细胞相比，细胞结构和功能是相类似的；来自不同菌丝部位的原生质体，生理生化特性不同，对诱变剂的敏感也不同，从菌丝顶端分离出的原生质体代谢活动要强；去壁后的原生质体对外界条件敏感，并且外界大分子如外源DNA等容易进入细胞内；原生质体在一定条件下容易再生成细胞壁而复原为完整细胞形态；原生质体由于剥去了细胞壁，等于失去了屏障，外界的因素本身对它就有影响，再加上用诱变剂诱变，对原生质体的变异作用更强可以提高诱变强度，增加诱变的力度，提高高频诱变的机率，使菌株变异的幅度大大加强，有可能从中筛选出变异特性更强、性状改变更大的菌株[2]2.3 曲霉原生质体的释放过程 曲霉原生质体和其他许多常见丝状真菌一样，可以从菌丝顶端和其他部位释放，同时出现菌丝膨大变形，这是由于细胞壁已被水解掉，细胞膜凸出将要成为原生质体原生质体释放时，通常是在菌丝体的释放部位先膨大形成一个小球体，然后该球体逐渐增大，最后脱离菌丝，有的还可以在原有的释放部位紧接着又形成一个或几个原生质体，这可能是由于菌丝体有关泡囊形成与细胞膜融合的机制所导致的。

有报道认为，在菌丝上缓慢膨大脱落的原生质体较为稳定，很快形成的原生质体则很脆弱释放的原生质体多呈球形，大小不一，直径为1 μm~20 μm，但以直径为5 μm~10 μm 的中等大小的原生质体最多，其原生质体中一般含一个巨大的液泡，其余的内含物呈月牙形，透明性较液泡差郝勃等在相差显微镜下详细地观察了2 株黑曲霉在最适条件下形成原生质体的过程结果表明，曲霉的原生质体均能从菌丝体的顶端及其他部位释放出来，释放的原生质体呈球形，大小不一，大多数原生质体内均能清晰地看见含有一个巨大的液泡[2]2.4 曲霉原生质体的制备制备原生质体是原生质体技术的前提和基础，但是不同微生物的细胞壁组成各不相同，所以制备其原生质体的最佳条件也存在着很大差异早期人们曾探索使用研磨等机械方法和超声波等物理方法来制备原生质体，制备效果都不理想，目前人们主要运用酶法来制备原生质体对于曲霉，由于其细胞壁组成较为复杂，人们多倾向于使用复合酶进行处理，常用的酶。