苹果早期落叶病抗性遗传趋势及分子标记研究.doc

苹果早期落叶病抗性遗传趋势及分子标记研究论文摘要：以秦冠、富士及其杂交F代为试材，连续3年对苹果褐斑病 （Marssonina coronarian （ElI.Et Davis） Davis）和斑点落叶病（Alternaira alternata f. mali ）进行田间调查，研究了两种病害的遗传趋势及F抗性表现，并进行了抗 病基因RAPD标记结果表明：亲本秦冠属抗病品种（2-3级）,富士属感病品 种（4级）；F代表现数量性状遗传规律，含有主效抗病基因；斑点落叶病的遗 传基因的加性效应贡献较大，褐斑病的遗传主要受基因的非加性效应影响；获得 1个与抗斑点落叶病基因连锁的RAPD标记S428-854，并成功转换为SCAR标 记 SCAR470o论文关键词：苹果，早期落叶病，遗传，标记，标记选育优质抗逆的苹果新品种是国内外苹果育种者不懈追求的目标，为减 少果品生产中农药使用量、降低环境污染，抗病性已成为苹果抗逆育种的热点 早在上世纪50年代，美国已开始有计划的开展苹果抗“火疫病、黑星病”育种， 并由3所大学合作成立PRI联合苹果育种计划，历经50多年已培育出40多个 抗病品种；欧洲于20世纪90年代创立DAR日durableappleresistanceinEurope ） 项目，以抗“黑星病、白粉病”为主要育种目标，也取得了很大成就。

迄今为止国 际上关于苹果抗病（火疫病、黑星病、白粉病等）育种进行了深入的研究，在基 础理论、育种技术等方面都取得了突破性进展我国苹果抗病育种研究起步较晚， 研究基础薄弱，沙守峰、阎振立等对苹果抗粗皮病和轮纹病进行了抗病性遗传变 异研究苹果早期落叶病是我国苹果生产中三大主要病害之一依据植物发病症 状特点可分为五种类型：褐斑病(Marssoninacoronarian(EII.EtDavis)Davis)N斑 病落叶病(Alternairaalternataf.mali)、圆斑病(Phyllostccasolitaria)、灰斑病 (Phyllostictapirina )、轮斑病(AlternariamaliRoberts ),其中褐斑病和斑点落 叶病危害最严重，常造成大片果树中下部叶片脱落，枝梢上苹果暴露在外,严重影 响苹果树的正常生长、花芽形成、果实增大和来年苹果的产量与品质目前日本、 中国等亚洲苹果主产国对苹果早期落叶病做了一些研究，主要集中在病害流行规 律、分布、病原菌生物学和病害防治等方面，有关品种资源的抗性遗传变异规律 及育种研究鲜有报道本研究以秦冠和富士及其正反交F代为材料，通过连续3年的田间抗性 鉴定，研究了苹果早期落叶病抗性遗传趋势，并进行抗斑点落叶病基因的RAPD 和SCAR分子标记研究，旨在揭示我国苹果抗早期落叶病的遗传方式和特点及 杂交后代的抗性表现，为苹果抗病育种和杂交后代抗病性早期选择提供理论依 据。

1材料与方法1.1材料供试材料均取自西北农林科技大学白水苹果试验站2004年春进行杂 交，以秦冠和富士为亲本设计正反交，2005年春播种，获得4020株杂交实生 苗，其中秦冠x富士(正交)组合2300株，富士x秦冠(反交)组合1720株， 株行距为30cmx80cm ,常规管理，实验期间不喷施任何杀菌剂，本实验随机选 取正交385株，反交322株，亲本于2005年8月嫁接于同一苗圃内，各嫁接5 株，砧木为M261.2方法1.2.1病害调查标准苹果早期落叶病调查标准参照《农业部新农药田间药效试验准则》中斑 点病的分级标准，如表1所示表1苹果早期落叶病分级标准Tablel Classesofresista ncetoappleearlydefoliation disease病级代表值(X) Value of grade 病斑面积占叶面积比例(% ) Percentage of the disease spot on total leaf 褐斑病 Applebrown blot 斑点病 Alternaria leaf blotch0 X=0.0 X=0.0 1 0.075.0 X>65.0将病级按下式换算成病情指数：变异系数CV(%)=S/Xx100 ;组合传递±(%)=F/MPx100 ;亲中值二父母本平均病情指数相加/2(S:标准差；X:亲中值；F:F代平均值；MP:亲本平均值)，用DPS2005进行数据分析。

分别于2006 - 2008年在苹果早期落叶病的发病盛期，即7月中旬至9月 中旬进行3次调查，取平均值二年生杂交苗的调查：每棵树调查的叶片总数不 少于70片，不足70片的单株全部调查；三、四年生杂交苗的调查:S巨地面120cm 左右，按4个方位调查不少于100个叶片，统计各级病叶数，计算病情指数植株抗病性标准参考王昆等的方法，根据叶片病情指数，将其感病程度 分为以下5级(表2 L表2苹果早期落叶病抗性分级标准Table2Classesofresista ncetoappleearlydefoliatio ndisease级别Classes 抗病程度Level of resistance 病情指数(DI) Disease index 1 高抗(HR)High resistance 0.0< DI<5.0 2 抗病(R)Resistance 5.0 < DI<10.0 3中抗(MR)Middle resistance 10.0 < DI<30.0 4 感病(S)Susceptible 30.0 < DI < 50.0 5 高感(HS)Highsusceptible 50.0 < DI<1001.2.3RAPD标记及SCAR转换依据2006-2007年田间调查结果，以秦冠、富士、抗病单株、感病单株 及其71株杂交F1代为材料，在展叶10-25天时取3-5g新鲜的叶片，采用改良 CTAB法，参照王跃进的方法提取基因组DNA ,跟据集群分类法(BSA )的原 理，各选择7株高抗(1级)和高感(5级)单株建立抗、感基因池。

PCR 扩增体系如下:10xBuffer2.5k dNTP ( 10mmoL/L ) 0.5L MgCI2 (25mM )1.5k primer( 20moL/L )0.75L Taq( 5U/L )0.2L 模板 DNA( 40ng/L )1.0k ddH2O18.55l , Totalvolume25l0 94°C预变性 5min , 94°C变性 50s , 36°C 退火50s , 729延伸90s , 38个循环，72七延伸10min ,最后于49保存用 2.0%的琼脂糖凝胶，120V电压，电泳仆，用凝胶成象系统照像依据RAPD标记所获基因片段序列，运用PrimerPremier5.0软件设计 SCAR 弓I 物(5,ATTCGAAGGTTGGGATGGAG375,TAGCAGAAGTGACAAGAGGT3,)，用 所设计的引物对两亲本和构建的抗病池、感病池以及建池单株进行扩增2结果与分析2.1亲本抗性评价表3亲本抗性评价Table3Theresistanceestimationofparents品种 Variety 病害类型 Types of disease 病情指数（DI）Disease index 抗性级别 Level of resistance 表现型Phe no-type2006 年2006a2007 年2007a2008 年2008a平均Average秦冠Qingua n褐斑病brown blotdisease15.417.016.516.3A3MR中抗斑点病alternarialeaf blotch7.7 6.58.47.5A2R抗病富士Fuji褐斑病brownblot disease37.840.438.638.9B4 S感病斑点病altemaria leaf blotch 30.8 33.4 35.9 33.3B 4S感病注 f'A、B”示显著水平（P、B^Meanssignificantatl %leve对于两种病害富士叶片3年的平均病情指数明显高于秦冠（表3所示）, 褐斑病是秦冠的2.3倍，斑点病是秦冠的4.4倍，差异达到极显著水平。

秦冠对 两种病害的抗性明显高于富士，依据抗性标准秦冠属于（2・3级）抗病品种，富 士属于（4级）感病品种2.2杂交F代病害侵染规律及不同年份发病情况表4苹果杂交F代不同年份间抗病性的相关分析（2006 ~ 2008年）Table4Thecorrelati onan alysisofdiseaseresista ncein2006-2008病害类型Types ofdisease2006 年 /2007 年 2006a/2007a2006年/2008年组合 The combination of parentsQinguanxFuji褐斑病Brown blot disease0.85480.79430.8269斑点病 Alternaria leaf blotch0.86830.82490.8355富士 x秦冠FujixQingua n喝斑病 Brown blot disease0.83290.81160.7817斑点病Alternarialeaf blotch0.89680.88820.9175两种病害的相关性Correlatio nbetwee ntwodiseasens nsns注：++代表极显著相关性秦冠x富士2006a/2008a2007 年 /2008 年 2007a/2008aP=0.01 , +代表显著相关性P=0.05,ns代表没有显著相关性。

Notes++,+,nsreprese ntsign ifica ntcorrelatio natP=0・0hcoiTelatio natP=0.05,a ndno corr elati on respectively.苹果褐斑病主要侵染植株中下部老叶片，7-8月份出现高温多雨季节是褐斑病高发期，此时叶片开始脱落，植株不同基因型个体的抗感性明显表现出来；斑点落叶病菌主要侵染苹果新稍叶片，5-6月份出现一个侵染高峰，8-9月份是 发病盛期，因此寄生在秋稍叶片上的分生孑包子到9月份遇到高温多雨时大量繁 殖，此时叶片上的病斑明显表现出来不同年份间病害发生的相关性达到显著或 极显著水平（表4 ）,尤其是斑点病的相关系数3年间都达到极显著水平，说明 在不同年份间植株的抗性表现比较稳定，但是由于受到环境因素的影响，极少部 分植株的抗性表现会有所变化杂交F代对两种病害的抗性没有显著的相关性, 初步认为，这两种抗病基因不连锁，位于同一染色体相对较远的位置，或位于不 同的染色体上2.3杂交F代抗病性遗传变异分析图1苹果杂种F代病情指数分布图FigIDistributionofaveragediseaseindexofFprogenies由图1可知，杂交F代褐斑病和斑点病的病情指数呈连续性变异（植株抗性表型变异并不连续），不符合标准的正态分布规律，属于数量遗传中的阈值 性状。

因此秦冠富士两个苹果品种杂交组合对褐斑病和斑点病的抗性是受多基因。