基于λ核酸外切酶辅助放大的化学发光传感器用于DNA的灵敏检测.docx

          基于λ核酸外切酶辅助放大的化学发光传感器用于DNA的灵敏检测                    陈佳等摘 要 基于G-四链体/血红素 DNA酶的高催化活性以及λ核酸外切酶（λexo）的辅助放大功能，以17个碱基的DNA片段作为模型分析物，构建了一种快速、灵敏、特异性好的新型Luminol-H2O2-G-四链体/血红素 DNA酶化学发光传感体系考察了λexo用量、Luminol浓度、H2O2浓度、溶液pH值对体系化学发光强度的影响在最佳实验条件下，即：pH=9.0，10 units λexo， 1.0×103 mol/L Luminol，3.0 × 102 mol/L H2O2，测得DNA在2.0×1012～8.0×109 mol/L的浓度范围内与Luminol的相对化学发光强度之间呈现良好的线性关系，检出限（3σ）为0.7×1013 mol/L本方法可以区分不同错配的核酸序列，并可用于复杂生物样品的分析关键词 λ核酸外切酶；G-四链体/血红素DNA酶；化学发光；DNA1 引 言DNA是生物体遗传信息的载体[1]，构建快速、灵敏、高选择性的生物分析新方法用于低丰度的DNA序列的检测在临床诊断、基因筛选、食品和环境监测、国土安全等方面起着至关重要的作用[2，3]。

近年来，信号放大已经成为提高DNA检测灵敏度的重要手段，如采用纳米材料作为信号放大的标记物、采用聚合酶链反应（PCR）或者滚环扩增（RCA）等核酸扩增技术等虽然这些方法大大提高了检测的灵敏度，但是也存在操作繁琐、费时、价格昂贵、易出现假阳性信号等缺陷[4，5]使用限制性内切酶进行信号放大的方法，较以往的信号放大方法更为简单、快速，但是由于限制性内切酶只能针对特定的DNA序列，在实际应用中存在一定的局限性[6，7]因此，发展快速、灵敏的DNA测定新方法具有重要的理论和实际意义[8]λ核酸外切酶（Lambda exonuclease，λexo）是一种高持续性核酸外切酶，能够催化双链DNA分子自5′磷酸末端→3′方向逐步水解，并释放出5′-单核苷酸，进而将双链DNA变成单链DNA[9，10]λexo在核酸重组、复制、分型、基因修复以及分子克隆等方面起着至关重要的作用，已成为研究基因组成、功能及表达的重要工具之一此外，许多研究者将λexo的独特性质应用于核酸探针的信号放大技术，以实现核酸、蛋白质等生物分子的超灵敏检测[11～14]但是这些方法大多需要对核酸探针进行荧光标记，过程复杂且成本较高G-四链体/血红素 DNA酶（G-Quadruplexes/hemin DNAzyme）是一种具有催化性能的人工模拟酶，由富含鸟嘌呤碱基的核酸分子与血红素结合，形成稳定的G-四链体结构，表现出类似于辣根过氧化物酶的活性，能够催化H2O2氧化2，2′-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS）产生颜色变化或者催化H2O2氧化鲁米诺（Luminol）产生化学发光[15～17]，在生化分析领域已经引起研究者的广泛关注[18]。

化学发光（Chemiluminescence， CL）分析由于不需要激发光源，避免了背景光和杂散光的干扰，大大提高了信噪比，具有灵敏度高、线性范围宽、分析速度快、仪器设备简单等优势，目前已广泛应用于免疫分析、临床检验、环境检测、物质分析等领域[19～22]本研究采用3条核酸链构建DNA夹心结构，使用λexo进行目标DNA的辅助放大，建立了新型化学发光传感器，成功实现了DNA检测本方法具有操作简单、灵敏度高、特异性好等优势，可用于实际样品分析2 实验部分2.1 仪器与试剂LS-55型发光光度计（美国Perkin-Elmer公司）；PHSJ-4A型pH计（上海精密科学仪器有限公司）所有DNA片段均由上海生工生物有限公司提供（序列见表1）Luminol、H2O2（国药上海试剂公司）；血红素（Hemin）、N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸（HEPES）购于美国Sigma公司；λ核酸外切酶（Lambda exonuclease，λexo）、10×λexo反应缓冲液（0.67 mol/L Glycine-KOH（pH 9.4，25℃），0.02 mol/L MgCl2，500 μg/mL BSA）购于美国New England Biolabs公司。

其它试剂均为国产分析纯，实验用水为18.2 MΩ·cm的超纯水2.5 × 102 mol/L HEPES-NH4OH缓冲液（pH=7.4/8.0/8.5/9.0/9.5/10.0），含0.05%（w/V）Triton X-100，1%（V/V）DMSO，2.0×102 mol/L KCl和0.2 mol/L NaCl2.2 实验方法2.2.1 DNA的检测 将浓度均为1.0×105 mol/L的Auxiliary DNA、Phosphate-DNA、Hairpin DNA溶液以及不同浓度的Target DNA在95℃下加热10 min，再自然冷却到室温取出20 μL不同浓度的Target DNA与10 μL Auxiliary DNA、10 μL Phosphate-DNA，在37℃杂交2 h；杂交完成后，加入5 μL λexo （2 U/μL）及5 μL 10 × λexo反应缓冲液，在37℃下温育30 min随后，将上述混合溶液加热到75℃，保持10 min，再冷却至37℃，孵育1 h；加入10 μL Hairpin DNA，在37℃孵育30 min，再向上述混合溶液中加入20 μL Hemin（终浓度为2.0×107 mol/L）及820 μL HEPES-NH4OH缓冲溶液，充分混匀后，在室温下孵育1 h，保证Hemin与打开的Hhairpin DNA充分反应，形成稳定的G-Quadruplexes/hemin DNAzyme结构。

最后，依次将50 μL Luminol（终浓度为1.0×103 mol/L）、50 μL H2O2（终浓度为3.0×102 mol/L）加入到上述溶液中，在室温下立即测量样品的CL光谱 2.2.2 化学发光测定CL测量均使用光程为1 cm的比色池电压设置为800 V，狭缝宽度设为15 nm，扫描速度为1200 nm/min，测量时关掉LS-55型发光光度计的氙灯，测定样品溶液在425 nm处的相对化学发光强度ΔI（ΔI=I-I0， I0为无Target DNA存在时Luminol的化学发光强度， I为不同浓度的Target DNA存在时Luminol的化学发光强度）每个样品均平行测定3次3 结果与讨论3.1 实验原理实验原理如图1所示，本体系包括4种DNA：Target DNA、Phosphate-DNA、Auxiliary DNA、Hairpin DNA首先，Phosphate-DNA与AuxiliaryDNA及Target DNA进行杂交，形成DNA的复合结构随后向溶液中加入λexo，由于λexo可作用于5′磷酸化的双链DNA分子，并沿5′-3′方向渐进性催化去除5′单核苷酸，破坏双链DNA结构，同时释放出Auxiliary DNA及Target DNA。

释放出的Target DNA可以继续进入下一轮循环，不断产生大量Auxiliary DNA，而Auxiliary DNA可以将Hairpin DNA的茎环结构打开，打开的Hairpin DNA在血红素存在的条件下，可以形成稳定的G-Quadruplexes/HeminDNAzyme结构，表现出类似于过氧化物酶的活性，能够催化H2O2氧化Luminol产生化学发光，并且Luminol产生的相对化学发光强度与目标DNA的浓度在一定范围内成比例，从而可以实现Target DNA的定量分析检测3.2 可行性研究不同条件下的化学发光光谱（图2） 表明，单独的Hemin化学发光强度十分微弱（曲线a）；不加入Target DNA（曲线b）， 或者不加入λexo（曲线c）的情况下，体系的化学发光强度也较弱； 图2 不同体系的化学发光光谱Fig.2 CL spectra of hemin （a）， phosphate-DNA/auxiliary DNA/hairpin DNA/λexo/hemin （b）， phosphate-DNA/auxiliary DNA/hairpin DNA/target DNA/hemin （c） and phosphate-DNA/auxiliary DNA/hairpin DNA/target DNA/λexo/hemin （d and e）. Experimental conditions： 1.0×107 mol/L phosphate-DNA， 1.0×107 mol/L auxiliary DNA， 1.0×107 mol/L hairpin DNA， 5.0×1012 mol/L target DNA（curve d） and 8.0×109 mol/L target DNA（curve c and e）， 2.0×107 mol/L hemin， 10 units lambda exonuclease （λexo）， 1.0×103 mol/L Luminol， 3.0×102 mol/L H2O2加入λexo及Target DNA后，体系的化学发光强度增加，且Target DNA浓度越高，发光强度越高（曲线d和e）。

化学发光强度的增加是由于λexo催化水解磷酸化5′末端，释放Target DNA，并不断进入下一循环，产生大量的Auxiliary DNA，可以与Hairpin DNA形成大量的G-Quadruplexes/hemin DNAzyme结构上述结果表明，本方法可用于Target DNA检测3.3 测定条件的优化3.3.1 λexo用量对体系化学发光强度的影响 由于λexo用量直接影响目标DNA的循环效果，进而影响检测体系的化学发光信号的强弱，因此实验首先考察了λexo用量对体系化学发光强度的影响（图3），结果表明，体系的化学发光强度随着λexo用量的增加而逐渐增强，并且当λexo的用量达到10 units 时，体系的化学发光强度趋于稳定因此，实验将λexo的最佳用量定为10 units3.3.2 pH值对体系化学发光强度的影响 由于体系的化学发光强度与缓冲介质的pH值之间存在一定关系[6，16]，因此考察了不同pH条件对体系化学发光强度的影响实验结果如图4所示，所用HEPES-NH4OH缓冲溶液使体系pH值从7.4逐渐增加到9.0时，体系的化学发光强度逐渐增强，且在pH=9.0时达到最大值；之后继续增大pH值，体系的化学发光强度逐渐减弱。

最终选择pH=9.0的HEPES-NH4OH缓冲溶液作为最佳缓冲条件3.3.3 Luminol浓度对体系发光强度的影响 作为化学发光的底物，Luminol的浓度强烈影响体系的化学发光强度本研究考察了不同浓度的Luminol对体系化学发光强度的影响，实验结果如图5所示在0.4～1.0 mmol/L的浓度范围内，随着Luminol浓度的增加，体系的化学发光强度逐渐增强，且在Luminol浓度为1.0×103 mol/L时，发光强度达到最大值；之后继续增大Luminol的浓度，体系的化学发光强度反而呈现下降趋势因此选择Luminol的最佳浓度为1.0 mmol/L3.3.4 H2O2浓度对体系化学发光强度的影响 考察了化学发光的氧化试剂H2O2的浓度对体系化学发光强度的影响示从图6可见，H2O2浓度在5.0～30 mmol/L范围内，随着H2O2浓度增加，体系的化学发光强度逐渐增强；当H2O2浓度在30～50 mmol/L时，体系的化学发光强度逐渐减弱为了获得较大的化学发光强度，。