医学论文-用于基因治疗的慢病毒载体.doc

医学论文•用于基因治疗的慢病毒载体基因治疗有望成为治疗遗传病、肿瘤、病毒感染及其它难治性疾病的有效手 段，但目前基因转移方法的局限性成为实现这一希望的最人障碍非病毒学的基 因转移方法效率较低；已用于人体试验的基I大I治疗方案绝大多数是以病毒学方法 进行基因转移的，其中以逆转录病毒载体和腺病毒载体最为成熟常用的逆转录 病毒载体从小鼠口血病病毒(MLV)改造而来，虽可使目的基因整合至靶细胞基因 组、实现稳定表达，但只能转导分裂细胞，目前主耍用于基因治疗的离体方案； 腺病毒载体既能转导分裂细胞，亦可转导静止细胞，转导效率也较高，但FI的基 因不整合至靶细胞基因组，仅能短暂表达，而且腺病毒本身某些抗原的表达可引 起人体免疫反应，阻止其重复转导；其它一些病毒载体如腺相关病毒(AAV)载体、 单纯疱疹病W(HSV)载体亦因各种原因不能令人满意理想的病毒载体能同时提供高效的基因转移、长期稳定的基因表达及牛物安 全性近来，一些研究者把目光投向了以I型为人免疫缺损病毒(HIV-1)为代表 的慢病毒研究表明C1-51 ,以HIV-1为基础构建的这类慢病毒载体具有可感 染非分裂细胞、目的基因整合至靶细胞基因组长期表达、免疫反应小等优点，适 于体内基因治疗，因此有望成为理想的基因转移载体。

木文即对该类载体的研究 进展做一简介1 H1V-1基因组的基木结构[6]HIV-1 DNA前病毒的主要结构基因及其排列形式与其它逆转录病毒相同，均 为5’ LTR-gag-pro-pol-env-3z LTR其中gag基因编码病毒的核心蛋白，pol 基因编码病毒复制所需的酶类，erw基因编码病毒的包膜糖蛋白，pro基因则编 码切割蛋白前体所需的蛋白酶与其它逆转录病毒不同的是，H1V-1基因组尚有 较多调节基因，其中属于HIV-1基因复制所必需的tat基因和rev基因，分别编 码两个反式激活因子Tat蛋口和Rev蛋口，前者在HIV-1基因组复制和转录延伸 过程中发挥重要作用，后者则可促使HIV-1基因的表达由早期向晚期转化非 HIV-1复制所必需的调节基因有nef、vif> vpr和vpu这些基因的编码产物都 冇各自的功能，有些尚未完全阐明，在此不一一赘述2构建HIV-1载体系统的基木原理［7］HIV-1载体系统由两部分组成，即包装成分和载体成分包装成分由HIV-1 基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产 生病毒颗粒所必需的蛋白；载体成分则与包装成分互补，即含冇包装、逆转录和 整合所需的HIV顺式作用序列，同时具有界源启动了控制下的多克隆位点及在此 位点插入的目的基因。

为降低两种成分同源重组恢复成野生型病毒的可能，需尽 量减少二者的同源性，如将包装成分上5’ LTR换成巨细胞病毒(CMV)立即早期启 动了、3’ LTR换成SV40 polyA等包装成分通常被分开构建到两个质粒上，一 个质粒表达Gag和Pol蛋fl,另一个质粒表达Env蛋口，其目的也是降低恢复成 野生型病毒的可能图1所示为Trono等建立的HIV-1载体系统中的一种［1］ 将包装成分与载体成分的3个质粒共转染细胞(如人肾293T细胞)，即可在细胞 上清中收获只有一次性感染能力而无复制能力的、携带口的基因的HIV-1载体颗 粒3 HIV-1载体系统的改进近年來，已有多个实验室建立了复制缺陷的HIV-1载体系统，用于不同目的 的研究，如分析病毒的感染力［8］、筛选抗病毒药物［9］、评价Env糖蛋口的 不同区域在介导病毒进入细胞中的作用［10］等而目前对于以基因治疗为目的 的HIV-1载体系统，研究的焦点集中在如何扩大其嗜性范围、确保其安全性及提 供其滴度和转导能力上1996年以来，Trono领导的课题组发表了一系列令人鼓 舞的研究结果［1〜3］,主要包括以下几方面的改进3.1包膜蛋白最初的HIV-1载休颗粒，均由其本身的包膜蛋白Env所包裹，仅对CD4+的 细胞具有亲嗜性o 1996年,Trono课题组的Naldini等［1］设计的HIV-1载体 系统(见图1)采用表达水疱性口炎病毒(VSV)糖蛋口 G的质粒和双嗜性小鼠口血 病病毒(MLV)包膜蛋白Env的质粒，分別取代表达HIV木身包膜蛋白Env的质粒, 使HIV-1载体颗粒包上了 VSV或双嗜性MLV的包膜。

这样做的结果至少具有三 个方面的积极意义：①包膜的更换进一步降低了 HIV-1载体恢复成野生型病毒的 可能；②使HIV载体感染宿主的范围不再仅限T CD4+细胞，而扩大到几乎能感 染所有组织来源的细胞；③VSV的包膜赋予HIV载体颗粒高度的稳定性，使其能 够通过超速离心而浓缩，达到高滴度Naldini等已使HIV-1载体滴度由105转 录单位(TU)/ml达到108TU/ml这样的改进无疑是HIV载体系统走向应用而边出 的一大步3.2包装成分包装成分的构建应在不影响重组病毒的装配和感染力的前提下，尽可能地减 少无关的HIV-1蛋白的表达，为野生型病毒的恢复设置障碍Naldini等［1, 2］ 在构建包装质粒pCMVA R9和pCMV A R8.2时，分别在env基因阅读框架前插 入了多个终止密码子或删除了 cnv基因中1.4kp的序列，代之以终止密码子，以 阻止env基因的表达在此基础上，Zufferey等［3］将包装包装质粒上表达调 节蛋口 Ncf、Vif、Vp［和Vpu的4个基因分别删除或联合删除，结果发现它们对 于产生HIV-1载体颗粒是非必需的，即使完全删除，得到的载体颗粒仍具备转导 非分裂细胞的能力。

这4个调节蛋白或已被证实、或被高度怀疑是构成HIV毒性 的因素［11, 12］,将其删除、加上包膜蛋白的替换，可使制备HW载体过程中 产生野生型病毒的口j能必微乎具微3.3载体质粒载休质粒上HIV-1的顺式序列通常包括两端的LTR、剪切位点及包装信号中 等此外，研究表明［7］ , gag基因5’端的序列可提高载体RNA的包装效率； Rev蛋口需要与Rev反应组件(RRE)相作用，将未剪切的载体转录产物从细胞核 转运到胞浆因此，Naldini等［1〜3］在载体上保留了 gag基因5’端350bp 的序列及位于env序列中的RRE,提高了产生载体颗粒的能力对于载体上需含 冇多少顺式作用序列为最佳，目前尚不完全靖楚4 HIV-1载体介导基因转移的体内外实验迄今，Trono课题组构建的HIV・1载体系统已在体外转导过人子宫颈癌细胞 (HeLa)、鼠成纤维细胞(208F)、原代培养的人巨噬细胞、人呼吸道上皮细胞等， 结果表明［1-5］ , HIV-1载体无论对分裂细胞还是非分裂细胞均能转导，但对 非分裂细胞的转导效率与细胞所停止的周期冇关HIV-1载体对GO期细胞的转 导效率不如对静止于G1/S或G2期的效率高，停止于GO期的时间越长，这种差 别越大。

这可能是由于某些GO期细胞内脱氧核昔酸浓度低、影响了反转录步骤, 造成报告基因未表达所致的表观现象实际上，HIV-1载体有的已进入到GO期 的靶细胞内，建立了传录中间体一旦这类细胞进入细胞周期，载体所携带的基 因就会表达在动物体内实验中，Naldini等［1］将HIV载体注射成年大鼠脑组织，30 天后取脑组织，未观察到病理变化，免疫组化显示报告基因能够在终末分化的神 经元中表达，证明HIV载体对体内基因转移是有效的此后，他们将重组病毒在 转导前用dNTP和多胺处理，以增加病毒内逆转录反应，可使对大鼠神经元的转 录数率提高2倍，报告基因可表达3个月以上［2］Miyoshi等［4］将携带绿 色荧光蛋口 (GFP)基因的HIV载体注射大鼠眼球，GFP能在感光细胞和视网膜色 素细胞中表达，如果以视紫质启动子控制GFP,则可在感光细胞中特杲地高表达对于HIV-1载体进入非分裂细胞后的表达是否全部由整合形式产生，口前尚 有不同意见Naldini等［2］将包装质粒中的整合酶基因突变，如此而产生的HIV载体不能在非分裂细胞中表达，I大I此认为HIV载体的表达全部由整合形式产 生；而Goldman等［5］却在转导细胞中测到了 HIV载体前病毒的非整合形式, 认为不能排除两种形式同吋存在的可能。

在用HIV・1载体已经进行的所冇体内外实验中［1〜5］,未出现过冇复制力 的HIV,说明其安全性是有保证的5 HIV载体的基因治疗中的应用前景5.1获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的基因治疗［7, 13］目前对于AIDS的基因治疗方案，基本上是以逆转录病毒载休介导的方式， 将抗病毒基因体外导入CD4+T淋巴细胞或CD34+的造血祖细胞，再回输体内常 用的抗病毒基因包括自杀基因、反义RNA、核酶、RNA诱饵的相应DNA序列以及 调节蛋口或结构蛋口的突变体基因等由于这些治疗基因不能到达巨噬细胞和多 能干细胞，怵I此难以重建免疫；此外，体外操作费用昂贵，不适于大规模应用HIV-1载体的研究为AIDS的基因治疗带来了新的希望，它可能具有以下优 势：第一，利用HIV-1本身包膜蛋白Env包裹的载体颗粒可以将抗病毒基因直接 运抵CD4+T淋巴细胞和巨噬细胞，适丁直接的体内治疗，而包被了 VSV包膜的载体颗粒又能感染多能干细胞，有利于免疫重建；第二，患者体内的野生型H1V-1 可将携带抗病毒基因的载体拯救出来，使载体扩增并扩散到周围更多的细胞中发 挥抗病毒作用；第三，如果将抗病毒基因置于H1V-1木身的长末端重复序列(LTR)控制之下转导细胞，则只冇当HIV-1感染该细胞时，T珀蛋白反式激活LTR中的TAR组件，抗病毒基因才会表达，使基因表达具冇了靶向性。

5.2神经系统疾病的基因治疗[1, 2, 14]Lesch-Nyhan综合征是一种遗传性的代谢性脑病，rfl编码次黄嚓吟核糖转移 酶(HPRT)的基因缺陷所引起；帕金森氏病是一种退行性脑病，由于产生多巴的神 经元退化，导致大脑纹状休内多巴胺水平降低，临床上给患者注射左旋多巴可改 善症状，但长期注射及药物的副作用令患者难以承受较为理想的方式是在脑内 持续表达酪氨酸疑化酶(TH),使其催化酪氨酸转变为为左旋多巴；Alzheimer氏 病也是一种多因素引起的退行性脑病，造成大脑皮质和海马回神经元萎缩，通常 采用神经营养因了防止神经元退化由于HIV-1载体能够体内转导神经元并建立 长期稳定的表达，因此对于以上疾病的基因治疗非常具有吸引力可以设想，分 别将编码HPRT、TH或神经营养因子的基因通过HIV・1载体介导，体内注射至神 经元，有可能对上述疾病产生良好效果5.3血液系统疾病的基因治疗[15]造血干细胞一直被认为是对血液系统恶性肿瘤或其它疾病(如地中海贫血、镰刀性红细胞贫血、血友病等)进行基因治疗的理想靶细胞，但由于缺乏使目的 基因在造血干细胞稳定表达的方法，这方面的研究进展不明显尽管小鼠逆转录 病毒载体能够转导经细胞因子刺激后进入细胞周期的造血干细胞，但经此处理的 干细胞性质可能会发牛改变。

HIV载体则可通过直接转导静止的干细胞避免这类 问题将多药耐药(MDR)基因导入造血干细胞，可使其耐受大剂量化疗，可能成 为治疗白血病和其它恶性肿瘤的冇效途径；将正常珠蛋白基因或凝血因子vm、IX 分别导入造血干细胞，有望对地中海贫血、镰刀性红细胞贫血和血友病产生疗效5.4其它囊性纤维化(CF)是由于缺损囊性纤维性穿膜传导调节蛋白(CFTR)而引起的 一种人类遗传病，其特点是粘液腺功能不足，粘液中含冇异常糖蛋因而粘液 的粘度不正常而影响呼吸道上皮和消化道上皮，引起慢性感染，直至死亡［16］ 针对CF的基因治疗研究已进行了多年，试用过各种载体，效果不甚理想最近, Goldman等［5］用HIV-1载体进行了尝试，动物实验表明，导入CFTR基因后CF 缺陷可被纠正但他们同时也发现，HIV-1载体转导增殖中的呼吸道上皮细胞效 果较好，而。