实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验.ppt

实验实验 十十 一一 T T淋巴细胞玫瑰花结实验淋巴细胞玫瑰花结实验 College of Life Science and Technology, XINJIANG Univercity一、实验目的一、实验目的§1.1.掌握人淋巴细胞的制备原理和方法及绵掌握人淋巴细胞的制备原理和方法及绵羊红细胞悬液的制备羊红细胞悬液的制备§2.2.掌握淋巴细胞玫瑰花结制备方法并了解掌握淋巴细胞玫瑰花结制备方法并了解该技术在实际工作中的用途该技术在实际工作中的用途 人外周血人外周血T T淋巴细胞表面具有绵羊红细胞受体淋巴细胞表面具有绵羊红细胞受体, ,在体外在体外一定条件下将人淋巴细胞与绵羊红细胞两者混合一定条件下将人淋巴细胞与绵羊红细胞两者混合, ,可以可以形成以形成以T T细胞为中心细胞为中心, ,周围黏附着多个绵羊红细胞的花环周围黏附着多个绵羊红细胞的花环, ,为为E E花环试验花环试验(erythrocyte rosette test)(erythrocyte rosette test)应用最广应用最广的有总的有总E E花环试验花环试验(Et,t(Et,t为为totaltotal的缩写的缩写) )和和活性活性E E花环试花环试验验(Ea,a(Ea,a为为active active 的缩写的缩写) )。

EtEt代表被检标本中代表被检标本中T T淋巴细淋巴细胞的总数胞的总数,Ea,Ea则反映具有高亲和力绵羊红细胞受体的则反映具有高亲和力绵羊红细胞受体的T T细细胞数胞数, ,这部分这部分T T细胞的免疫学功能更能反映机体细胞免疫细胞的免疫学功能更能反映机体细胞免疫功能和动态变化功能和动态变化 E E花环试验主要用于了解机体细胞免疫功能广泛应花环试验主要用于了解机体细胞免疫功能广泛应用于肿瘤免疫、移植免疫及免疫性疾病的研究用于肿瘤免疫、移植免疫及免疫性疾病的研究, ,为某些为某些疾病诊断和防治提供免疫学方面的重要参考疾病诊断和防治提供免疫学方面的重要参考二、实验原理二、实验原理n nE E玫瑰花环实验玫瑰花环实验→→判断细胞免疫功能判断细胞免疫功能TBTT T淋巴细胞玫瑰淋巴细胞玫瑰花结电镜照片花结电镜照片T T淋巴细胞玫瑰淋巴细胞玫瑰花结示意图花结示意图三、实验仪器、材料和试剂三、实验仪器、材料和试剂1 1、材料、材料§无菌抽取的人静脉血无菌抽取的人静脉血, ,加入事先有适量肝素加入事先有适量肝素液的试管内液的试管内, ,混匀抗凝混匀抗凝§健康绵羊红细胞健康绵羊红细胞§小牛血清（经小牛血清（经56℃30min56℃30min灭活）。

按灭活）按1010：：1 1加加入洗过的压积兔红细胞，混匀于入洗过的压积兔红细胞，混匀于37℃37℃吸收吸收30min30min，，4℃4℃冰箱过夜然后以冰箱过夜然后以2000r/ min2000r/ min离离心心10min10min取上清液经蔡氏滤器过滤后，无取上清液经蔡氏滤器过滤后，无菌条件下分装于小瓶低温保存菌条件下分装于小瓶低温保存三、实验仪器、材料和试剂三、实验仪器、材料和试剂2、、试剂试剂Ø抗凝剂：抗凝剂：1%的肝素钠生理盐水溶液的肝素钠生理盐水溶液Ø0.90%0.90%的生理盐水的生理盐水ØAlsverAlsver‘s s溶液ØHankHank溶液Ø细胞分层液：上海试剂二厂产品细胞分层液：上海试剂二厂产品Ø0.8%0.8%戊二醛溶液：使用前戊二醛溶液：使用前15min15min用生理盐水或用生理盐水或HankHank液配制Ø染色液：瑞氏或染色液：瑞氏或GiemsaGiemsa染液Ø1%1%醋酸溶液醋酸溶液 三、实验仪器、材料和试剂三、实验仪器、材料和试剂3 3、仪器、仪器§光学显微镜、离心机、水浴锅、血细胞计数光学显微镜、离心机、水浴锅、血细胞计数板、板、50UL微量加样器、医用剪刀及眼科镊微量加样器、医用剪刀及眼科镊子、蔡氏滤器、刻度离心管（子、蔡氏滤器、刻度离心管（10ml）、滴管）、滴管及吸管、载玻片和盖玻片。

及吸管、载玻片和盖玻片四、方法与步骤四、方法与步骤§1.1.绵羊红细胞悬液的制备绵羊红细胞悬液的制备§依无菌手续从从绵羊颈静脉取血，放置依无菌手续从从绵羊颈静脉取血，放置4 4倍倍体积的体积的AlsverAlsver’s s 液中，摇匀（放置液中，摇匀（放置4℃4℃冰冰箱保存，限箱保存，限7 7～～1010天内用）天内用）§临用前用临用前用HankHank液洗涤液洗涤3 3次，每次次，每次1000r1000r，离，离心心5min5min取压积的绵羊红细胞取压积的绵羊红细胞用用Hank液配液配成成1% 的细胞悬液（的细胞悬液（ 约约2×107 个个/ml））四、方法与步骤四、方法与步骤洗涤后悬浮的红血球洗涤后悬浮的红血球红血球在血球计数板上的密度红血球在血球计数板上的密度密度梯度离心分离纯密度梯度离心分离纯化淋巴细胞示意图化淋巴细胞示意图四、方法与步骤四、方法与步骤§2.2.淋巴细胞的分离和制备淋巴细胞的分离和制备Ø取取1 1支洁净、干燥的离心管加入支洁净、干燥的离心管加入人抗凝血人抗凝血1ml1ml，再加入，再加入1mlHanks1mlHanks液稀释血液；液稀释血液；Ø取取1 1支洁净、干燥的离心管，加支洁净、干燥的离心管，加入入1ml1ml细胞分层液；细胞分层液；Ø用吸管吸取上述稀释血液，沿用吸管吸取上述稀释血液，沿离心管管壁加于细胞分层液的离心管管壁加于细胞分层液的表面（不能冲乱液面）。

以表面（不能冲乱液面）以3000r/min3000r/min离心离心20min20min，可出现，可出现分层，详见图分层，详见图 经离心分离纯化后经离心分离纯化后的血浆和分层液之的血浆和分层液之间的灰白色淋巴细间的灰白色淋巴细胞照片胞照片 四、方法与步骤四、方法与步骤Ø用吸管将血浆和分层液之间的乳白色淋巴细胞层用吸管将血浆和分层液之间的乳白色淋巴细胞层吸至含液的离心管中，混合后后吸至含液的离心管中，混合后后2000r/min2000r/min离心离心5min5min弃上清，沉淀用弃上清，沉淀用HankHank液重复洗一次，于沉液重复洗一次，于沉积细胞中加液混匀积细胞中加液混匀, , 取取2 20ul淋巴细胞悬液，加淋巴细胞悬液，加0.78ml1%0.78ml1%的醋酸混匀，将淋巴细胞配成的醋酸混匀，将淋巴细胞配成5x105x106 6个个/ml/ml3.3.反应：取淋巴细胞悬液（反应：取淋巴细胞悬液（5×105×106 6个个/ml/ml）；加入灭活）；加入灭活吸收的小牛血清，再加入吸收的小牛血清，再加入2×102×107 7 个个/ ml/ ml绵羊红细绵羊红细胞悬液混匀；使淋巴细胞与绵羊红细胞的比例分胞悬液混匀；使淋巴细胞与绵羊红细胞的比例分别为别为1 1：：8 8（活性玫瑰花结）。

置（活性玫瑰花结）置37℃37℃孵育孵育5min5min，，其间轻轻摇动其间轻轻摇动2~32~3次 取出离心管，以取出离心管，以500 r / min500 r / min离心离心5min5min，将离，将离心管置心管置4 40 0冰箱放置冰箱放置5min5min 取出后轻轻旋转混匀（切不可甩动试管，以免花取出后轻轻旋转混匀（切不可甩动试管，以免花环脱落）沿管壁加入环脱落）沿管壁加入0.8%0.8%戊二醛溶液戊二醛溶液3 3滴，再轻滴，再轻旋转混匀置旋转混匀置4℃4℃，，5min5min 自冰箱取出后，以自冰箱取出后，以500 r / min500 r / min离心离心5min5min，弃，弃上清，沉淀混匀制片上清，沉淀混匀制片四、方法与步骤四、方法与步骤4、制片、制片 取取1滴标本悬液滴于载玻片上（载玻片事先浸在滴标本悬液滴于载玻片上（载玻片事先浸在蒸馏水中置蒸馏水中置4℃冰箱），使悬液自然均匀铺开，待自冰箱），使悬液自然均匀铺开，待自然干燥或微风吹干后，用瑞氏染液染色然干燥或微风吹干后，用瑞氏染液染色5~10min用自来水冲去染液，待干燥后镜检计数。

自来水冲去染液，待干燥后镜检计数5、计数方法、计数方法 在高倍镜或油镜下数在高倍镜或油镜下数200个淋巴细胞，每个淋巴个淋巴细胞，每个淋巴细胞结合细胞结合3个以上的绵羊红细胞为玫瑰花结形成细胞个以上的绵羊红细胞为玫瑰花结形成细胞形成玫瑰花结的淋巴细胞数目以百分率表示形成玫瑰花结的淋巴细胞数目以百分率表示四、方法与步骤四、方法与步骤五、实验结果五、实验结果T T淋巴细胞玫瑰淋巴细胞玫瑰花结光镜照片花结光镜照片1.1.一定要用新鲜血，否则会影响细胞活性，且红细一定要用新鲜血，否则会影响细胞活性，且红细 胞受体会从胞受体会从T T细胞表面脱落细胞表面脱落 2.2.计数前，重悬和混匀细胞要轻柔，否则花结会散计数前，重悬和混匀细胞要轻柔，否则花结会散 开消失六六. .注意事项注意事项七七. .思考题思考题§试述试述E E玫瑰花结实验的目的及其意义玫瑰花结实验的目的及其意义§简述活性简述活性E E玫瑰花结实验条件玫瑰花结实验条件§计算实验中形成活性玫瑰花结的百分率计算实验中形成活性玫瑰花结的百分率注：注：E E花结形成百分率花结形成百分率 = = 形成花结细胞数形成花结细胞数/ /（花结细（花结细胞数胞数+ +未形成花结细胞数）未形成花结细胞数）X100%X100%。