几丁质酶的活性测定(精).docx

几丁质酶活性的测定⑴几丁质酶几丁质是绝大多数真菌细胞壁的主要成份，而在植物中却不存在但高等植物普遍存在着几丁质酶，并可通过几丁质酶催化几丁质的水解，使植物具有抵御真菌侵染的能力（ShibuyaandMinami,2001）在正常情况下，高等植物的几丁质酶表达水平很低，而当植物体遭受到病原真菌、细菌和病毒侵染，机械创伤或乙烯处理时，其表达活性显著增强特别是在P-1,3-葡聚糖酶的协同作用下，可明显抑制真菌的生长（Sela-Buurlageetal.,1993）几丁质酶是植物体中与防御有关的一种次生水解酶，是植物广谱防御机制的一个成分（VanLoonandVanStrien,1999），它能催化真菌细胞壁的重要成分——几丁质的水解，从而抑制真菌的生长增殖，提高植物的抗真菌能力而植物体中尚未发现几丁质酶作用的底物，所以，几丁质酶在植物体中诱导与积累，对于增强植物的抗病能力有重要作用几丁质酶主要水解几丁质多聚体P-1,4键，产生N-乙酰葡聚糖胺寡聚体，水解可以是外切作用也可以是内切作用① ⑵试剂的配制胶状几丁质的制备称取粉末状几丁质（甲壳素，sigma）5.0g,缓慢加入200mL（三4°C）预冷的浓HC1中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，待几丁质粉末均匀分散后，在水浴中轻度搅拌并缓慢加热至37C混合物的粘度迅速增加，几分钟后粘度开始下降，混合物逐渐变得清亮。

当几丁质基本上溶解完毕时，用玻璃棉过滤，将滤液倒入2000mL预冷（＜4C）的蒸馏水中，搅拌，几分钟后几丁质沉淀，溶液变得混浊,30分钟后停止搅拌，将悬液置于冰箱（＜4C）沉淀过夜倒掉上清，剩余部分用双层中性滤纸抽滤，沉淀用蒸馏水洗涤数次，待pH达到5以上时，加数滴1NNaOH使溶液呈中性将上述中性沉淀物加到200mL的蒸馏水中，剧烈搅拌重新悬浮，即为胶体几丁质溶液取该溶液5mL,105C烘箱干燥至衡重，测定溶液几丁质的含量（胶体几丁质溶液的几丁质含量为mg/mL）,并将胶体几丁质溶液浓度稀释为1%② 1%对二甲氨基苯甲醛（1%DMAB）称取1g对二甲氨基苯甲醛，加入少量冰醋酸溶解，再加1.25mL浓HCl，最终用冰醋酸定容至100mL.（溶液呈黄色）饱和硼砂称取5.0g四硼酸钠（Na2B4O7^10H2O），溶于100mL热水中，冷却后备用① ⑶几丁质酶活性的测定几丁质酶的提取称取0.1g水稻叶片，液氮研磨成粉末，加2mL醋酸提取液（0.05mol/L，pH5.0）,转移入2mL离心管，4C下12000r/min离心15min,上清液转移到新的1.5mL离心管中，4C冰箱中保存备用② 外切几丁质酶活性测定1.2mL反应混合液中含0.4mL粗酶提取液、0.4mL醋酸缓冲液（0.05mol/L，pH5.0）和0.4mL胶体几丁质溶液（1%）。

37C水浴反应2h后，4000r/min离心10min,终止反应参考Reissig等（1955）的方法测定上清液中的N-乙酰葡萄糖胺量方法是取0.4mL上清液，加0.2mL饱和硼砂溶液（上清液即刻变黄色），沸水浴7min，冷却后再加2mL冰醋酸和1mL1%对二甲氨基苯甲醛（DMAB）溶液，37C水浴保温15min后（溶液呈红色），585nm处测定溶液吸光值③ 内切几丁质酶活性测定取0.4mL上述上清液，加40吐1%蜗牛酶溶液,继续在37C反应30min,用上述Reissig等（1955）的方法测定产生的N-乙酰葡萄糖胺量，即得总几丁质酶活性总几丁质酶活性减去外切几丁质酶活性，即为内切几丁质酶活性一个酶活性单位（U）定义为每克鲜植物组织每小时分解胶体几丁质产生1聘N-乙酰氨基葡萄糖的酶量④N-乙酰葡萄糖胺标准曲线的制备配制100yg/mLN-乙酰葡萄糖胺(N-Acetyl-D-glucosamine,GlcNAc)母液管号123456789100yg/mLGlcNAc(mL)00.050.100.150.200.250.300.350.40H2O(mL)0.40.350.300.250.200.150.100.050GlcNAc浓度(yg/mL)012.525.037.550.062.575.087.5100.0加0.2mL饱和硼砂溶液沸水浴7min冷却，加2mL冰醋酸、1mL1%DMAB37°C水浴保温15min后(溶液呈红色)585nm处测定吸光值。

参考文献：肖拴锁，王钧.水稻中超氧诱导与稻瘟菌抗性及苯丙氨酸解氨酶、几丁酶、卩-1,3-葡聚糖酶活性诱导的关系.中国水稻科学,1997(02):93-102.ReissigJL,StromingerJL,LeloirLF.AmodifiedcolorimetricmethodfortheestimationofN-acetylaminosugars.JournalofBiologicalChemistry,1955,217:959-966.Sela-BuurlageMB,PonsteinAS,Bres-VloemansSA,MelchersLS,vandenElzenPJM,CornelissenBJC.Onlyspecifictobacco(Nicotianatabacum)chitinasesand卩-1,3-glucanasesexhibitantifungalactivity.PlantPhysiology,1993,101(3):857-863.ShibuyaN,MinamiE.Oligosaccharidesignallingfordefenceresponsesinplant.PhysiologicalandMolecularplantpathology,2001,l59:223-233.VanLoonLC,VanStrienEA.Thefamiliesofpathogenesis-relatedproteins,theiractivities,andcomparativeanalysisofPR-1typeproteins.PhysiologicalandMolecularPlantPathology,1999,55(2):85-97.。