植物花粉超低温贮藏进展思考.doc

1植物花粉超低温保存的研究近况超低温保存是指在-80C （干冰温度）至-196C （液氮温度）哄至更低温度下保存生物材料 ［1］近年来，植物种质资源研究工作取得了显着成就，而液氮超低温（-196C）保存是目前唯一 可行的长期而稳定地保存种质资源的方法花粉保存是种质资源保存的方法2—，1922年 Knowlton最早报道了经-18CTC贮存的金鱼草花粉尚有活力我国上世纪80年代中期开始植 物种质资源超低温保存研究至今,利用液氮超低温保存花粉，已经在作物［2,3］、蔬菜（包括 西甜瓜）［4,5,6］、果树⑺、花卉苗木［8］、茶树⑼、药材［10］等植物上取得了一定的进展 利用液氮超低温保存花粉的一般程序是:花粉采集一花粉干燥一花粉低温预处理一投入液氮 容器保存一花粉解冻一用于科研生产超低温保存方法以玻璃化法和干冻法较常见2植物花粉超低温保存效果的影响因素2.1花粉的发冇程度进行超低温保存的花粉，其发冇稈度对保存效果有一定的影响，一般成熟的花粉保存效果 比幼嫩花粉要好，而且幼嫩花粉对保存条件比较敏感，只有在适宜条件下才有好的保存效果 ⑸浙贝母花粉研究表明当天开花的花粉比开花前一天和开花后一天的花粉更适宜低温保存 ［10］。

2. 2花粉含水量超低温保存过程中,花粉含水最是影响花粉寿命的主要因素含水量过高或过低，都会使 花粉细胞受损而丧失生活力因此为了保证保存效果，必须使花粉含水量控制在适当的范囤 内不同植物的花粉存活的水分极限值是不一样的水稻花粉含水量在5.旷29. 6%时,经液氮 保存后均有结实率，最高可达65. 0%［2］;广杏花粉超低温保存的最适含水量是23. 2辽0. 8%,该 范围内花粉液氮保存后的发芽率报高［7］;黑麦花粉超低温保存的适宜含水量范围在 6. 0~15・5%［3］;玉米花粉含水量下限值为2%［3］o花粉含水量愈低，经LN2贮藏示保持生活力 愈高［8］,但是过度脱水会使花粉萌发率降低［4, 7, 9, 11］2. 3花粉保存时问利用正确的步骤对植物花粉进行超低温保存，保存时间的长短对花粉的生活力没有显着 影响［5, 8］魔芋花粉在液氮中保存1个月或6个月，其萌发率基木不变,仍表现出“冷刺激” 现象［4］含水量为9.11%的水稻花粉保存7d示,其结实率与未经贮存的对照花粉无极显着差 异⑵2. 4预冻处理从收集到的资料中整理得到，预冻处理在马铃薯、番茄和紫菜苔等花粉超低温保存中应 用其中紫菜苔和马铃蒋采用逐步降温（0C~-10C~-40C/-20C~-196C）方法进行处理，发现 超低温保存后花粉活力明显高于其它处理［5］。

同时研究发现，预冻处理的温度也会影响保存 效果在蒂茄花粉超低温保存的试验中，取蒂茄花粉装在冻干管中，分别放置在0C、-25C和 -230C温度下预冻30minJn\立即投入液氮中，10 □后结果表明,（TC和-230C预冻处理和有•接 投入LX2的速冻处理的花粉萌发率相近，而-25C预冻处理的花粉,超低温保存丿F萌发率提高 了⑹2. 5冷冻保护剂冷冻保护剂的使用能减少超低温保存造成的伤害目前常用的冷冻保护剂有二甲基亚砚 (DMSO)、甘油、糖和糖醉等，在花粉超低温保存中以DMSO和蔗糖为主，其中蔗糖浓度对花粉保 存效果有明显的影响［5］2. 6解冻方法对花粉超低温保存效果的影响超低温保存花粉的关键是解冻问题，处理不当将会给花粉造成危害一般的花粉解冻都是 在三个温度段(0~3C, 22~25C, 35~40C水浴)下讲行的，结果表明示两个温度段的解冻效果相 当不错，而0飞C下解冻在蒂茄和秤锤树花粉保存中也得到不错的效果［6,8］也有用自来水 或流水解冻的，其中番茄和海棠花粉用||来水解冻后萌发率高于其他解冻方法［6］除了以上 6个主要煤响因索外,花粉干燥温度［4］、干燥时间、贮藏光线、测花粉活力时的培养温度和 培养基都会对花粉保存效果的测定有一定影响。

3超低温保存麻花粉活力和遗传性变化3. 1花粉活力测定花粉活力的测定方法有5种，(l)TTC法:此法也可用于种了生活力的测定2)联苯胺染 色法:有生命力的花粉细胞含有脱氢酶，能使TTC还原成三苯基化合物而染色，无生命力的花 粉没有这种反应,就不会染色3)花粉萌发活力测定法:为花粉提供适宜的萌发条件,有较强 活力的花粉就会萌发出花粉管,无活力的花粉就不能萌发花粉管$2倍花粉育径就是萌发 马铃薯、番茄、魔芋、网纹甜瓜、茶树、杏、榆叶梅和海棠都采用过萌发法测定花粉活力 (4)FDA染色法:梁立等用此法测定紫菜苔和油菜花粉活力5)田间授粉计算结实率:这是衡 量花粉生活力最肓接而又最具实用价值的指标在黑麦、玉米和番茄等植物花粉活力测定中 使用过3. 2遗传性的变化近年来，对花粉超低温保存示遗传性的研究不多其中赵树仁等在对帝茄花粉超低温保存 时观察了游离脯氨酸的变化，发现在液氮中贮藏的花粉脯氨酸含量为5. 78 u g/mgFW,与新鲜 花粉5. 15 U g/mgFW没有明显变化［6］石思信等对衩谆d鄢 臀卤4 ?〜2年后的遗传形状作了 比较详细的研究，结果表明：(1)冷冻花粉后代植株幼苗色、叶绿色、叶中脉、叶鞘色，花药色, 花丝色，果穗和了粒等遗传性状与对照没有差界;株高、穗粒数和穗长等数量性状多对基因及 其连应的作用，与对照相比差异不明显［3］。

⑵在观察实验材料时，对照和超低温保存花粉母 细胞都没有发现染色体数目变异;在观察具有终变期和中期1分裂相的所有花粉母细胞中，没 有发现多价体，但终变期出现少数8”状染色体;花粉母细胞减数分裂后期发现不同稈度的“染 色体桥”和“断片” ［3］,不正常染色体比例与对照相比出现频率没有增加⑶液氮保存的花 粉其后代过氧化物酶同工酶和淳溶蛋H图谱没有发现异常［3］4展望花粉保存作为种质资源保存的方法Z—，可以被应用到有必要或希望保存花粉以备示用 的情况下把冷冻管从液氮中取出，拿出一些花粉后再将冷冻管放冋液氮中，这样对仍留在冷 冻管中的花粉没有明显影响但是如果预期取花粉时要间歇，那么将花粉分装在不同的冷冻管 会比较好根据花粉母细胞减数分裂形花粉粒时的核数目，植物花粉分为两类:二核型花粉和 三核型花粉三核型花粉因外壁较薄、对干燥敏感，比二核型花粉寿命短，保存困难苹果、 梨、桃等是二核型花粉，保存时间较长水稻、麦、玉米是二核型花粉寿命较短，但是已经取 得了这类花粉保存困难的突破利用超低温保存技术，杂交水稻恢复系花粉在含水量适当的范 围内，保存后的花粉均能结实［2］;玉米花粉经过一年的超低温保存，还有36. 5%到53.概的结 实率［11］。

这样许多珍稀的种质资源或濒临灭绝的种质资源，都可以通过超低温保存技术以花 粉的形式长期而安全的保存下来植物花粉超低温保存在国内毕竟开展时间不长，许多问题还有待进一步的验证和探讨o花 粉超低温保存研究集中在成熟花粉方而，对未成熟花粉超低温保存的研究工作,就我收集的资 料表明，国内迄今还儿乎是空白因此今后在这方面开展工作，将会对冇种工作缩短周期起到 很好的推动作用超低温保存时运用的冷冻保护剂无法洗尽，对花粉细胞有一定的影响，是否 对花粉的活力冇抑制、促进作用或没有副作用还待进一步研究冷冻解冻过程温度的突然变 化是否会诱导细胞发生突变总之，到目前为止，超低温保存花粉在解决杂交冇种花期不遇、 异地植物杂交困难、缩短冇种周期、保存种质资源、延长花期寿命、保持植物遗传多样性方 面是简便有效的途径同时可减少冇种过程中父木种植面积，也可以为血临濒危的植物和稀有 植物提供一条种质保存新途径。