拟南芥启动子功能研究.doc

反向遗传学方法研究启动子关键序列摘要切除启动子的不同区段后通过报告基因的衣达强度來判断启动子的关键序列1. 引言1.1拟南芥作为高等植物研究的模式植物的理由拟南芥命周期煎，仅冇一个月：这种杂草状的I•字花科植物，在所冇植物中基因组率先 被完整破译.拟南芥只有五对染色体，基因组较小；基因操作方便培养条件：气候室牛长, 温度18-22° C,空气湿度70%-80%,光照强度300 u mol/s m2MS培养基:Murashige和Skoog于1962年为烟草细胞培养设计的，其特点是无机盐和 离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例介适, 能满足植物细胞的营养和生理需要，因而适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用它 作为培养基的基本培养基1.2 报告基因（reporter gene）报告基因是一种编码容易被检测的蛋白质或酶的基因，也就是一个其表达产物非常容易 被鉴定的基因把它的编码序列和基因表达调节序列相融介形成嵌介基因，或与其它日的基 因相融合，在调控序列控制下进行农达，从而筛选得到转化体，并利用它的农达产物來研究 目的基因的表达调控报告基因一般具备以卜•特点：（1）报告基因产物必须区别于转染前真核细胞内任何相似 的产物；（2）受体细胞内其它的基因产物不会干扰报告基因产物的检测；（3）报告基因编码 的产物的检测应该快速、简便、灵敏度高而且重现性好。

选择何种报告基因系统是根据研究的目的、组织与细胞的类别、信号检测的时间性与空 间性，以及首选的检测方法而定报告基因gus基因存在于E. coli等一些细菌基因组内，编码B-葡萄糖苛酸酶B-葡 萄糖甘酸酶是一个水解酶，以B-葡萄糖井酸酯类物质为底物，其反应产物可用多种方法检 测出来由于绝大多数植物没有检测到術萄糖昔酸酶的背景活性，因此这个基因被广泛应用 于植物基因调控的研究中下面是常用的GUS检测方法：（1） 组织化学法 检测以5-渙-4-氯-3」引味-[3 -葡萄糖昔酸（X-Gluc）作为反应底 物，将被检材料用含冇底物的缓冲液浸泡若组织细胞发生了解gus基因的转化，并表达出 Gus,在适宜的条件下，该猶就可将X-Gluc水解牛成蓝色产物这是由其初始产物经氧化二 聚作用于形成的靛蓝染料，它使具Gus活性的部位或位点呈现蓝色，用肉眼或在显微镜下可 看到，口在一定程度下根据染色深浅可反映th Gus活性因此利用该方法可观察到外源基因 在特定器官、组织，其至单个细胞内的衣达情况最为常用2） 荧光法（灵感度为分光光度检测法最高） 以4-甲基伞形酮酰-P-D®萄糖醛酸昔为底物，GUS催化其水解为4-甲某伞形酮及B-D荷萄糖醛酸。

4-甲基伞形酮分子中的 耗基解离后被365nm的光激发，产生455nm的荧光，可用荧光分光光度计定量1.3盐芥液泡焦磷酸酶基因启动子（TsVPD科研工作中发现，盐芥液泡焦磷酸酶基因启动子(TsVPl)在除了种子以外的所有组织 小都有活性，它的活性在根和叶中能被盐诱导，尤其在根尖中为了研究启动子的关键序列, 构建了盐芥液泡焦磷酸酶基因启动子(TsVPl)不同长度启动区控制的衙萄糖昔酸酶 (GUS)载体pCAMBIA1391z (PTsVP: :GUS),转染拟南芥,获得转基因拟南芥PT1, PA1和P7 发现PT1, PA1和P7具有不同的GUS活性及盐诱导活性表明启动区长度对启动子功能有影 响，由此推测启动子的关键序列及诱导特点构建了盐芥液泡焦磷酸酶基因启动子(TsVPl)不同长度启动区控制的匍萄糖昔酸 酶(GUS)载体pCAMBTA1391z (PTsVP: :GUS),转染拟南芥,获得转基因拟南芥PT1, PT2和 P8PT9o2. 实验材料 2.1实验材料2. 1. 1材料拟南芥种子PT1、PT2、PT7、PT82. 1. 2试剂母液I (大量元素20X )为10 ml,母液II (微量元索200X), III (铁盐200X ), IV (有机成分200X),蔗糖，蒸锚水，NaOH溶液，HC1溶液，琼脂粉，NaCl, 70%乙醇， 10 % 次氯酸钠,0. 1M \a2HP04 , 0. IM NaH2P04 , 10%0ml 100mM K2Fe(CN)6 , lOOmM K2Fe (CN) 4 , X-Gluc, DMF, 90%丙酮。

2. 1. 3器具pH计,玻璃棒,胶头滴管200ml量筒,10ml量筒,50讷量简,锥形瓶若干，培养皿, 电子天平，髙压蒸汽灭菌锅，枪头，枪，记号笔，标签纸，密封条，离心管，冰箱，温箱, 体视显微镜，照相机，烧杯2. 2实验方法2. 2. 1配制MS培养基MS培养基：Mumshige和Skoog于1962年为烟草细胞培养设计的，其特点是无机盐和 离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐禽量高，其养分的数量和比例合适, 能满足植物细胞的营养和生理需要，因而适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用它 作为培养基的基本培养基MS培养基组成:成分分子量使用浓度(mg/L)人M: 元素硝酸钾 KN03101. 111900硝酸彼 NH4N0380. 041650磷酸二氢钾 KH2P04136. 09170硫酸镁 MgS04.7H20246. 47370氯化钙 CaC12.2II20147. 02440微量 元素碘化钾 KI166.010. 83硼酸 H3B0361.836.2硫酸猛 MnS04.4II20223.0122.3硫酸锌 ZnS04. 7 H20287. 548.6钥酸钠 Na2Mo04. 2 H20241.950. 25硫酸铜 CuS04. 5 1120249. 680. 025氯化钻 CoC12.62237. 930. 025铁盐乙■-胺P4乙酸.钠Na2. EDTA372. 2537.3硫酸亚铁 FeS024. 7H20278. 0327.8有机 成分肌醇100甘氨酸2盐酸硫胺素 VB10. 1盐酸毗哆醇 VB60. 5烟酸 VB5或VPP0.5蔗糖 sucrose342.3130g/L琼脂 agar7 g/L配制母液的优点是：1、避免每次配制培养基都要对儿I•种成分进行称量。

2、减少了称 量微量元素造成的谋差配制MS培养基：（1） 用量筒和移液枪从各种母液中分別取出所需的用量：母液I （大量元素20X）为 10汕，母液II （微量元素200X）、III （铁盐200X）、IV （有机成分200X）各lmL,加 入烧杯中，再加入蔗糖6g,加蒸懾水至175mL左右2） 用滴管吸取物质的量浓度为1 mol/L的NaOH溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，边 滴边搅拌，并随时用pH计测培养液的pH, 一直到pH为5. 8为止（培养基的pH必须严格控 制在5. 8）3） 在大量筒中定容至200mL,倒入锥形瓶，加入1.6g琼脂粉4） 同样的方法配制200mL含盐的培养基，在第（1）步中加入2.34g NaClo（5） 称0. 005g左右的琼脂粉与10mL蒸係水混合，配成0. 05%琼脂液6） 高压灭菌第一，码放锥形瓶将装有培养基的锥形瓶直立于金属小筐中，再放入高压蒸气灭菌锅 内第二，放置其他需耍灭菌的物品将其他需要灭菌的物品也放入高压蒸气灭菌锅内，如 用牛皮纸包裹的培养皿、枪头、无菌水、琼脂液等第三，灭菌待需要灭菌的物品码放完毕，盖上锅盖在98 kPa. 121.3 °C下，灭菌 20 min。

笫四，灭菌后取出锥形瓶，让其中的培养基口然冷却凝固，或立即倒平板2. 2. 2培养拟南芥幼苗（1） 培养皿分装培养基将锥形瓶中的培养基加热融化，在超净工作台上将其趁热倒入四个培养皿，令其口然冷 却凝固2） 种子灭菌种子在EP管内经体积分数70%乙醇漂洗lmin,无菌水洗1次，等量无菌水和10%次 氯酸钠混合浸洗lOmin,无菌水洗5遍，授后加入质量分数0. 05%的琼脂液悬浮，分别均 匀撒于平板上3） 适宜环境培养培养条件：在人工气候室培养，调节温度20°C,湿度75%,光照300mnol/s m2,光周 期16h光照/8h黑暗4) 盐处理将MS培养基上培养-一周多的植株収10株左右转移到含有200mmobL-lNaCl的培养基上 相同条件下培养16小时，剩下一半原条件继续培养2. 2. 3拟南芥的GUS组织化学染色对检测为阳性的植株进行GUS表达的组织化学检测，程序如下：(1) 将处理的植物材料放入1. 5mL或7mL离心管中(视材料而定)，加入X-Gluc反应液 (50mM pII7. 0 磷酸钠 缓冲液,0. 5mM K3 [Fe (CN) 6], 0. 5mM K4 [Fe (CN) 6]. 3H20, lOmM EDTA, 0. l%TritonX-100,2 mM X-gluc)浸没材料；(2) 37°C染色 10-16h ；(2)组织用70%乙醇脱色三次，观察，拍照。

附：GUS染液的配制母液♦ 20mM X-gluc i n dimethyformami de♦ 0. 2mM Na2HPO4♦ 0. 2mM NaH2P04♦ lOOmM EDTA♦ lOmM高铁氤化钾♦ 1% Triton-XlOO最终反应液(lOOul)0. 2mM Na2HPO 430.5ul0. 2mM NaH2P04 19. 5ullOOmM EDTA lOullOmM高铁孰化钾 lOul1% Triton-XlOO lOulX-gluc 母液 5ulddH20 15ul3. 实验结果如下面图片所示:T1无盐T1加盐T2无盐T2加盐T7无盐T7加盐T8无盐 T8加盐分析：T1和T2相比,T2大叶和小叶染色都明显比T1浅，说明缺失的部分a能增强GUS基因 的表达T2的小叶没冇染色，说明缺失的部分基因可能与GUS基因在小叶中的表达冇关T2和T7相比,T7染色较浅，说明T7相对T2缺失的序列b对GUS表达有增强作用并 Fl. T7小根基本没有染色，说明缺火部分序列b对GUS基因表达影响较大T7和T8相比,T7大叶染色与T8相似，说明T7相对T8缺失的启动子序列c对于GUS 基因表达作川效果影响相对较小。

但是T8中小叶染色明显，说明在缺失的启动子序列c中 存在调控GUS基因在小叶中表达的序列根据T1与T2的对比,说明T2相对T1中缺失的序 列a与T8相对T2缺失的序列共同影响GUS基因在小叶中的表达T1和T2经盐处理后,染色明显加深,而且T2小叶中也出现轻微染色，说明盐处理能 促进GUS基因的农达T7经盐处理厉，染色不明显，说明存留的启动子序列对GUS基因表达的作用已经不是 很强烈了T8经盐处理后，小叶染色略深，说明确实启动子序列对GUS基因在小叶中的表达冇抑 制作用大叶染色布明显，说明存留的启动子序列対GUS基因表达的作用已经不是很强烈了T1和T2未固定和固定的染色情况对比发现，未固定的染色效果明显，染色效果更深， 并且T2人叶明显染色，而小叶没有染色经结果讨论推断，启动子关键序列有可能存在与PT7与PT2序列之间，但是由于7、2 号拟南芥染色差别不明显。