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第五章第五章蛋白质结构解析蛋白质结构解析人体基因数目仅比低等生物线虫多两倍人体基因数目仅比低等生物线虫多两倍如此少的基因是如何创造出人体如此复杂如此少的基因是如何创造出人体如此复杂的生命活动？的生命活动？人体基因的主要功能是通过蛋白质来实现人体基因的主要功能是通过蛋白质来实现的，的，蛋白质扮演着构筑生命大厦的主要角蛋白质扮演着构筑生命大厦的主要角色人体中大约有人体中大约有1010万种蛋白质万种蛋白质 测定蛋白质结构的意义测定蛋白质结构的意义蛋白质三维结构解析方法蛋白质三维结构解析方法vX-X-射线晶体衍射法：射线晶体衍射法：85.3% 85.3% v核磁共振波谱：核磁共振波谱：14.7%14.7%v电镜三维重构、各种光谱技术、显微电镜三维重构、各种光谱技术、显微 技术和计算机模拟技术和计算机模拟 蛋白质三维结构解析过程蛋白质三维结构解析过程l1895年年11月月8日日,德国物德国物理学家，理学家，50岁的伦琴在岁的伦琴在自己的实验室中偶然发自己的实验室中偶然发现现一种从阴极射线管一种从阴极射线管中辐射出的新型射线，中辐射出的新型射线，由于对管子发出的由于对管子发出的“东东西西”性质不确定，伦琴性质不确定，伦琴就把这种射线命名为就把这种射线命名为“X射线射线”。

图片出处: 伦琴实验室伦琴实验室第一节第一节 X-X-射线衍射测定蛋白质结构射线衍射测定蛋白质结构人类第一张人类第一张X光照片光照片图片出处: 伦琴妻子之手伦琴妻子之手 1896年年1月月23日伦日伦琴将这一重大发现在维琴将这一重大发现在维尔兹堡物理医学会上报尔兹堡物理医学会上报告Kolliker教授提议教授提议将该射线命名为将该射线命名为“伦琴伦琴射线射线”,但伦琴却说：但伦琴却说：“我还没有彻底解释这我还没有彻底解释这种射线的发生现象，还种射线的发生现象，还是称它为是称它为X射线最恰当射线最恰当威廉威廉康拉德康拉德伦琴伦琴WilhelmConradRntgenl1901年第一届诺贝尔物理学奖评选时，年第一届诺贝尔物理学奖评选时，29封推荐信中就有封推荐信中就有17封集中推荐他伦封集中推荐他伦琴最终获得了第一次诺贝尔物理学奖金琴最终获得了第一次诺贝尔物理学奖金图片出处 诺贝尔物理奖奖章诺贝尔物理奖奖章诺贝尔物理奖奖章诺贝尔物理奖奖章X射线本质射线本质 X射线是一种短波长射线是一种短波长(0.00510nm)、高能量高能量(2.5105 1.2102eV)的电磁波的电磁波它是原子内层电子在高速运动电子流冲它是原子内层电子在高速运动电子流冲击下，产生跃迁而发射的电磁辐射。

击下，产生跃迁而发射的电磁辐射l一般由高速电子撞击金属产生如图所示，是一种产生一般由高速电子撞击金属产生如图所示，是一种产生X射线的真空管，射线的真空管，K是发射电子的热阴极，是发射电子的热阴极，A是由钼、钨或是由钼、钨或铜等金属制成的阳极两极之间加有数万伏特的高电压，铜等金属制成的阳极两极之间加有数万伏特的高电压，使电子流加速，向阳极使电子流加速，向阳极A撞击而产生撞击而产生X射线AX射线衍射射线衍射l1912年年Max von Laue发现发现X射线具有衍射线具有衍射的现象射的现象1914年的诺贝尔物理学奖）年的诺贝尔物理学奖）图片出处图片出处: : 劳厄的实验装置劳厄的实验装置 图片出处图片出处:X-X-射线晶体结构分析基本原理射线晶体结构分析基本原理 lX射线衍射分析所依赖的基本原理是射线衍射分析所依赖的基本原理是X射线衍射现象射线衍射现象l X射线衍射现象射线衍射现象利用利用X射线的波长和晶体中原子的大小及射线的波长和晶体中原子的大小及原子间距同数量级的特性来分析晶体结构原子间距同数量级的特性来分析晶体结构 l当当X射线入射到样品晶体分子上时，分子上的每个原子使射线入射到样品晶体分子上时，分子上的每个原子使X射线发生散射，这些散射波之间相互叠加形成衍射图形。

射线发生散射，这些散射波之间相互叠加形成衍射图形 l衍射图形能给出样品内部结构的许多资料，如原子间的衍射图形能给出样品内部结构的许多资料，如原子间的距距离离、键角键角，分子的，分子的立体结构立体结构、绝对构型绝对构型、原子和分子的、原子和分子的堆堆积积、有序或无序的、有序或无序的排列排列等 X X射线通过红宝石晶体射线通过红宝石晶体( (a)a)和硅单晶体和硅单晶体( (b)b)所拍摄的劳厄斑所拍摄的劳厄斑图片出处图片出处:劳伦斯劳伦斯布拉格布拉格( Lawrence Bragg)亨利亨利亨利亨利 布拉格布拉格布拉格布拉格( (HenryHenry Bragg) Bragg)因在用因在用X射线研究晶体结构方面所作出的杰出贡射线研究晶体结构方面所作出的杰出贡献献 ,亨利亨利布拉格布拉格（WilliamHenryBragg）和和劳伦劳伦斯斯布拉格布拉格（WilliamLawrenceBragg）父子分享了父子分享了1915年的诺贝尔物理学奖年的诺贝尔物理学奖图片出处图片出处 图片出处图片出处 l20世纪世纪60年代解析一个蛋白质结构可以获年代解析一个蛋白质结构可以获 得诺贝尔奖；得诺贝尔奖；l20世纪世纪70年代解析一个蛋白质结构则可成年代解析一个蛋白质结构则可成 为轰动世界的新闻；为轰动世界的新闻； l20世纪世纪80年代解析一个蛋白质结构则可申请到教授的职位；年代解析一个蛋白质结构则可申请到教授的职位；l20世纪世纪90年代解析一个蛋白质结构通常可以获得博士学位；年代解析一个蛋白质结构通常可以获得博士学位；l今天，一个博士研究生也许就可解析多个蛋白质结构，但如今天，一个博士研究生也许就可解析多个蛋白质结构，但如果没有深入研究其结构与功能的关系，往往不能毕业。

果没有深入研究其结构与功能的关系，往往不能毕业蛋白质结构解析的发展蛋白质结构解析的发展饶子和院士饶子和院士HIV基质蛋白基质蛋白 SARS射线衍射用于蛋白质结构的测定射线衍射用于蛋白质结构的测定l1954年年伯纳尔伯纳尔(Bernal)获得第一张胃蛋白获得第一张胃蛋白酶晶体衍射图片酶晶体衍射图片l1957年年肯特罗肯特罗(Kendrew)完成肌红蛋白的完成肌红蛋白的0.6 nm分辨率的蛋白质晶体结构分辨率的蛋白质晶体结构图片出处: 图片出处: 肌红蛋白的三维结构肌红蛋白的三维结构 肌红蛋白的三维结构模型肌红蛋白的三维结构模型图片出处:图片出处: http:/ archive/Kendrew62.html 1959年年佩鲁茨佩鲁茨(Perute)完成血完成血红蛋白红蛋白0.55分辨分辨率的晶体结构率的晶体结构图片出处: (1962) 血红蛋白的四级结构血红蛋白的四级结构 模型模型图片出处 血红蛋白分子就是由二个由血红蛋白分子就是由二个由141个氨基酸残基组成的个氨基酸残基组成的亚基和二个由亚基和二个由146个氨基酸残个氨基酸残基组成的基组成的亚基按特定的接触和排列组成的一个球状蛋白质分子，每个亚基中各有亚基按特定的接触和排列组成的一个球状蛋白质分子，每个亚基中各有一个含亚铁离子的血红素辅基。

四个亚基间靠氢键和八个盐键维系着血红蛋白分一个含亚铁离子的血红素辅基四个亚基间靠氢键和八个盐键维系着血红蛋白分子严密的空间构象子严密的空间构象 由于测定出蛋白质的精细结构由于测定出蛋白质的精细结构, ,两位英国科两位英国科学家学家M.F.M.F.佩鲁茨佩鲁茨和和J.C.J.C.肯德鲁肯德鲁获得获得19621962年的诺年的诺贝尔化学奖贝尔化学奖图片出处：图片出处： 1997年年,核小体八组蛋白结构核小体八组蛋白结构 2004年年,菠菜捕光复合物菠菜捕光复合物LHC-II2005年，线粒体膜蛋白复合物年，线粒体膜蛋白复合物2精细结构精细结构X射线衍射测定蛋白和核酸精细结构，为射线衍射测定蛋白和核酸精细结构，为新药设计新药设计提供了全新方向提供了全新方向中国科学家研制抗癌新药首获瑞典爱明诺夫奖施一公抗癌抗乙肝病毒新药施一公抗癌抗乙肝病毒新药Birinapant，进入临床二期，进入临床二期蛋白质蛋白质X X射线晶体结构测定程序射线晶体结构测定程序 l1、样品制备、样品制备 l2、蛋白质结晶和晶体生长、蛋白质结晶和晶体生长 l3、衍射数据收集和处理、衍射数据收集和处理 l4、位相求解、位相求解 l5、模型建立和修正、模型建立和修正 1、样品制备、样品制备 l大量表达、分离和纯化目标蛋白大量表达、分离和纯化目标蛋白 一般要求纯度大于一般要求纯度大于97%，浓度达到浓度达到5mg/ml以上。

以上2、蛋白质结晶和晶体生长、蛋白质结晶和晶体生长 蛋白质结晶原理蛋白质结晶原理 与小分子结晶一样，蛋白质在溶液中处于与小分子结晶一样，蛋白质在溶液中处于过饱和状态时，分子间可以规则的方式堆过饱和状态时，分子间可以规则的方式堆积起来形成晶体析出积起来形成晶体析出 蛋白质晶体生长的影响因素蛋白质晶体生长的影响因素l物理因素物理因素：温度温度、重力、重力、压力压力、震动、时间、电场磁场、震动、时间、电场磁场、介质的电解质性质和粘度、均相或非均相成核等介质的电解质性质和粘度、均相或非均相成核等l化学因素化学因素：pH值、沉淀剂值、沉淀剂类型和浓度、添加剂、离子种类型和浓度、添加剂、离子种类、离子强度、类、离子强度、过饱和度过饱和度、氧化还原环境、蛋白质浓度等、氧化还原环境、蛋白质浓度等l生化因素生化因素：蛋白质纯度蛋白质纯度、配合体、抑制剂、化学修饰、遗、配合体、抑制剂、化学修饰、遗传修饰、蛋白质的聚集状态、蛋白质水解、蛋白质自身的传修饰、蛋白质的聚集状态、蛋白质水解、蛋白质自身的对称性、蛋白质的稳定性和对称性、蛋白质的稳定性和等电点等电点等等蛋白质结晶方法蛋白质结晶方法 （1）批量结晶法（）批量结晶法（Batchcrystallization）（2）透析法）透析法(Dialysis)（3）液相扩散法液相扩散法(Liquiddiffusion)（4）气相扩散法（气相扩散法（Vapourdiffusion）（5）蛋白质结晶新方法蛋白质结晶新方法（1）批量结晶法（）批量结晶法（Batchcrystallization）l通过在待测结晶蛋白质溶液的通过在待测结晶蛋白质溶液的体积、浓度体积、浓度和和组成固定组成固定的条件下，直接将的条件下，直接将不同量的饱和不同量的饱和沉淀剂沉淀剂加入未饱和的蛋白质溶液以产生一加入未饱和的蛋白质溶液以产生一个浓度梯度而使蛋白质在不同的过饱和溶个浓度梯度而使蛋白质在不同的过饱和溶液中结晶。

液中结晶 （2）透析法）透析法(Dialysis)l利用利用半透膜半透膜允许小分子透过而大分子不能透允许小分子透过而大分子不能透过的性质来调节蛋白质溶液的沉淀剂浓度、过的性质来调节蛋白质溶液的沉淀剂浓度、pH或离子强度，从而使蛋白质溶液缓慢形或离子强度，从而使蛋白质溶液缓慢形成过饱和状态以形成晶核成过饱和状态以形成晶核该法是培养蛋该法是培养蛋白质晶体的常用方法白质晶体的常用方法3）液相扩散法液相扩散法(Liquiddiffusion)l利用利用液相平衡原理液相平衡原理而设计的由于蛋白质在而设计的由于蛋白质在不同溶液中的溶解度不同，把待结晶蛋白质不同溶液中的溶解度不同，把待结晶蛋白质溶液缓慢加入溶液缓慢加入溶解性差异大的溶剂溶解性差异大的溶剂中，在界中，在界面处形成沉淀剂浓度梯度在局部达到瞬间过面处形成沉淀剂浓度梯度在局部达到瞬间过饱和，从而促使晶核形成饱和，从而促使晶核形成4）气相扩散法（气相扩散法（Vapourdiffusion）l把待结晶蛋白质、把待结晶蛋白质、高于高于此蛋白质结晶所需盐此蛋白质结晶所需盐浓度的溶液和浓度的溶液和低于低于这种浓度的盐溶液放在一这种浓度的盐溶液放在一个密闭体系内，两种浓度不同的溶液由于发个密闭体系内，两种浓度不同的溶液由于发生生蒸汽扩散蒸汽扩散最后达到平衡，随着溶液中沉淀最后达到平衡，随着溶液中沉淀剂浓度的增加蛋白质溶解性降低，从而蛋白剂浓度的增加蛋白质溶解性降低，。