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基于超高效液相色谱飞行时间质谱技术的肺炎支原体感染小鼠血清代谢组学研究 [摘要] 采用超高效液相色谱与串联四级杆飞行时间质谱（UPLCQTOFMS）联用技术的代谢组学方法，分析肺炎支原体（MP）感染小鼠血清内源性代谢物的变化，筛选出与肺炎支原体肺炎（MPP）相关的潜在生物标记物，分析代谢通路，探讨MPP的致病机制采用MP滴鼻感染的方法建立小鼠MPP模型，肺组织病理切片、IgM和支原体核酸的含量测定结果显示造模成功利用UPLCQTOFMS方法分析MP感染小鼠的血清代谢轮廓，利用主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLSDA）方法进行数据处理结果显示MP感染模型小鼠的血清代谢谱与正常小鼠有显著差别，经数据库检索、质谱信息匹配，筛选出包括鸟氨酸、皮质醇、维生素A、色氨酸等47种生物标志物，涉及视黄醇代谢、精氨酸与脯氨酸代谢、甾类激素合成等17条代谢通路该文建立了基于UPLCQTOFMS技术的MP感染小鼠血清代谢组学研究方法，从整体水平反映了MP感染小鼠内源性小分子的代谢变化，为进一步在分子水平进行药物筛选与评价奠定了基础 [关键词] 肺炎支原体； 代谢组学； 超高效液相色谱飞行时g质谱； 模式识别 Serum metabonomics in mice infected with mycoplasma pneumoniae by UPLCQTOFMS WEI Wenfeng， CHU Yantao， LIU Ye， HUO Jinhai， WANG Weiming* （Heilongjiang Academy of Chinese Medical Sciences， Harbin 150036， China） [Abstract] Ultra high performance liquid chromatography coupled with tandem quadrupole time of flight mass spectrometry（UPLCQTOFMS） was applied to metabonomics study in BALB/c mice infected with mycoplasma pneumoniae（MP） to analyze the changes in serum endogenous metabolites， identify potential biomarkers associated with mycoplasma pneumoniae pneumonia（MPP）， analyze the metabolic pathway and explore the pathogenic mechanism of MPP. The BALB/c mice were inoculated with MP by repeated intranasal infectious routes to establish MPP models， and the results of the lung tissue biopsy， IgM and mycoplasma nucleic acid content determination showed that the models of MP in BALB/c mice were successfully established. UPLCQTOFMS was used to analyze the serum metabolic profiling of BALB/c mice infected with MP， and then principal component analysis（PCA） was combined with orthogonal partial least squares discriminant analysis（OPLSDA） for data processing. The results showed that there were significant differences in serum metabolic profile between the MP infected mice and the normal mice. Fortyseven potential biomarkers such as ornithine， cortisol， vitamin A and tryptophan were screened out by database searching and MS information matching. These potential biomarkers related to 17 metabolic pathways including retinol metabolism， arginine and proline metabolism， steroid hormone synthesis and so on. The metabonomic research method for serum of mice infected with mycoplasma pneumoniae based on UPLCQTOFMS was established in this study. The metabolic changes of endogenous small molecules in mice infected with MP were reflected in the overall level， laying the foundation for the selection and evaluation of MPP drugs. [Key words] mycoplasma pneumonia； metabolomics； ultraperformance liquid chromatography coupled with quadrupole timeofflight mass spectrometry； pattern recognition 肺炎支原体（mycoplasma pneumonia，MP）是引起呼吸道疾病和全身性病变的重要致病菌之一，可引起肺炎支原体肺炎（mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP）。

它是学龄前儿童和青少年时期最常见的肺炎之一，发病率为19.6%～21.9%，呈逐年增加趋势[1]小儿肺结构发育不完善，经过反复感染后，极易受损MP主要通过飞沫传播，引起上呼吸道和肺部感染，同时引起脑炎、 心肌炎、 肝炎、 关节炎等肺外组织或器官的病变临床表现多种多样，严重时出现暴发型肺炎，发展迅速，最终因呼吸衰竭而死亡[2] MPP临床检测主要利用病原体培养法和血清学检测确证病原学检测结果阳性率低，病原体培养结果明显滞后，并且每种诊断都有其局限性，临床上常采用多种检测手段联合应用的方式，但是仍有高达40%～50%的社区获得性肺炎不能确定相关病原体，严重影响早期的抗菌药物选择[3]代谢组学从整体观出发，以机体代谢物组变化为载体，以时空动态性和全局性观点，试图全面解析疾病对机体的影响[4]代谢组学技术已经在实验动物模型评价中展现了其特色和优势[56]，但目前关于支原体肺炎代谢组学的研究尚未见报道 本研究利用代谢组学研究方法，以MP感染小鼠血清为研究对象，采用UPLCQTOF 液质分析，并通过化学计量学模式识别的方法，发现潜在的生物标志物（potential biomaker）并鉴定，解析代谢通路。

从代谢组学角度阐明MPP的致病机制，为其有效防治提供新理论，促进治疗MPP药物的筛选和开发 1 材料 ACQUITYTM UPLC液相色谱仪（美国Waters公司）；Sciex 5600+型质谱仪（美国AB Sciex公司）；IKA MS3 digital涡旋振荡器（广州仪科实验室技术有限公司）；DH5000型电热恒温培养箱（上海一恒仪器有限公司）；LDZX75KB型立式蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）；DLCJ1N型超净工作台（北京东联哈尔仪器制造有限公司）；ST16R型高速低温离心机（美国赛默飞世尔科技有限公司） 肺炎支原体国际标准菌株FH（ATCC15531，美国菌种保藏中心）；PPLO培养基（碧迪医疗器械有限公司）；乙醚（分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司）；核酸定量检测试剂盒（广州中山大学达安基因股份有限公司）；甲醇（色谱级，Merck公司）；乙腈（色谱级，Merck公司）；甲酸（色谱级，Thermo Scientific）；屈臣氏蒸馏水（广州屈臣氏食品饮料有限公司） BALB/c雄性小鼠20只，SPF级，体重（202）g，北京维通利华实验动物有限公司提供，许可证号SCXK（京）2012001。

饲养于黑龙江中医药科学院动物实验中心，环境温度 （202） ℃，相对湿度 （5020）% 2 方法 2.1 支原体培养与造模方法 支原体培养参见文献[7]小鼠支原体肺炎模型采用支原体滴鼻感染方法，将20只BALB/c小鼠随机分为空白组和模型组，每组10只，乙醚麻醉，模型组取MP培养液20 μL缓慢滴入BALB/c小鼠鼻孔内，每日1次，连续感染3 d空白组给予无MP的培养液 2.2 样品采集与预处理 小鼠于造模结束后24 h采集颖荆采集前禁食12 h，各组由眼眶取血，血液静置1 h后于3 000 r・min-1离心10 min取血清，-80 ℃冻存取血后处死小鼠，剪取左肺组织10%甲醛固定，用以病理切片观察；剪取右肺组织用于支原体核酸定量检测 HE 染色实验：取甲醛固定的肺组织，用乙醇梯度脱水，二甲苯透明2 次，放入石蜡内进行包埋蜡块修好后固定于石蜡切片机上切片，将完全展开的蜡片贴附于清洁载玻片上，常规HE 染色，在显微镜下进行MP 特异性病变间质性肺炎的病理组织学检查 血清IgMMP测定：取各组血清样品，同时设定对照孔和标准样品孔，每孔加入50 μL样品，50 μL IgM结合物，室温孵育1 h，洗去孔内液体，加入100 μL底物，室温孵育30 min，加入100 μL终止液，于450 nm下读取吸光度值。

支原体核酸含量测定：取肺组织100 mg加入100 μL纯水，匀浆，吸取20 μL，加入等量DNA提取液，100 ℃保温10 min，8 000 r・min-1离心5 min，取上清液2 μL用于测定，同时设立标准曲线样本、质控样本，测试方法参照试剂盒说明书设定相关程序 代谢组学样本测定：每个样本取100 μL血清，加400 μL甲醇，涡旋30 s，4 ℃条件下13 000 r・min-1离心10 min，取上清液用于代谢组学分析 2.3 色谱条件 Waters Acquity UPLC BEH C18 色谱柱（2.1 mm100 mm，1.7 μm）；流动相0.1%甲酸水（A）0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脱，0～3 min，95%～40%A，3～4 min，40%A，4～9 min，40%～0%A，流速0.3 mL・min-1； 柱温50 ℃；样品仓温度4 ℃；进样量3 μL；色谱仪流出液不分流直接注入质谱仪进行正负离子扫描检测 2.4 质谱条件 采用ESI离子源，离子化模式为电喷雾正、负离子模式，正离子扫描模式参数：离子源电压5 500 V；离子源温度550 ℃；雾化气55 psi（1 psi=6.895 kPa）；辅助气55 psi；气帘气35 psi。