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    MicroRNA在植物药用天然活性物质代谢途径中的调控作用    刘天怡 金朝霞Reference：植物体中含有丰富的具有生理活性的化合物，其代谢过程错综复杂且受多元调控MicroRNA（miRNA）是约23 nt大小的非编码RNA分子，属于参与基因调控的反式作用因子在植物中，miRNA主要通过与靶基因的特异性结合来对其进行转录后水平的调控近年来，关于植物miRNA的研究发展得非常迅速越来越多的研究表明，miRNA几乎参与调控了植物各个生长阶段的生理过程药用天然活性物质主要来源于相关植物的次生代谢miRNA主要通过靶向作用植物细胞次生代谢途径上的酶及转录因子，或者通过影响植物激素的信号转导来调控次生代谢产物化学成分的合成本文介绍了miRNA的生物合成、作用机制和生理功能，以及与植物化学相关的次生代谢的常见途径，主要综述了近年来国内外对miRNA在一些具有药用活性的植物天然化学产物合成过程中的调控作用的研究进展，并且展望了未来对药用植物中miRNA的研究方向Keys：miRNA;药用植物;次生代谢;植物化学;活性物质Q946.8;Q943.2  ： A：1002-1302（2019）16-0034-05收稿日期：2019-06-10基金项目：国家自然科学基金（编号：31670604、31570303）;辽宁省自然科学基金（编号2015020659）。

作者简介：刘天怡（1993—），女，辽宁鞍山人，硕士研究生，研究方向为代谢调控与合成生物学通信作者：金朝霞，副教授，主要从事天然活性物质与次生代谢调控研究1 概述1.1 MicroRNA简介MicroRNA（miRNA）是一类由21～24个核苷酸所组成的单链非编码RNA分子，由真核生物内源产生，通过RNA聚合酶Ⅱ转录之后演变为对应的茎环结构，随后进行相应的剪切加工处理，进而获得成熟状态的miRNA其主要功能是在转录后水平通过翻译抑制、靶标mRNA切割和表观遗传学修饰等方式下调基因表达[1-2]1993年，Lee等在秀丽新杆小线虫（Caenorhabditis elegan）中鉴定出第1条miRNA分子lin-4[3];2000年，Reinhart等虫中鉴定出第2条miRNA分子let-7[4]2002年，Reinhat实验室在拟南芥中鉴定出16条miRNA分子[5]，从此，科学家们开始了关于植物中的miRNA的研究迄今为止，越来越多的研究表明，miRNA是很多植物中最重要的基因表达调控元件之一，参与调控几乎所有的植物生理代谢过程，例如干细胞的维持和分化、器官发育、信号转导、调控次生代谢，并参与响应非生物胁迫及再生的过程[6]。

1.2 miRNA的作用机制1.2.1 植物miRNA合成植物miRNA的合成实际上是MIRNA基因表达的过程，关系到转录、转录后剪切加工以及与AGO蛋白结合生成RISC复合体等步骤植物的初级miRNA（pri-miRNA）主要由MIRNA基因通过RNA聚合酶Ⅱ转录而来大多数保守的MIRNA基因的启动子结构与编码蛋白质的基因启动子很相似，具备TATA框及转录因子结合位点，所以miRNA的生物合成与蛋白质的翻译也会受到相关转录因子的影响[7]转录因子是真核生物中可以和一些特定基因的启动子区域的顺式元件产生特异性相互作用的DNA结合蛋白，这些蛋白依靠特异性相互作用而激活或是抑制相关基因的转录，进一步调控下游基因的表达例如拟南芥转录因子TCP（TEOSINTE BRANCHED/CYCLOIDEA/PCF）家族最早的研究发现与cycloidea（CYC）和teosinte branched 1（TB1）蛋白基因编码相似的蛋白，都可以演变为非典型的螺旋-环-螺旋[non-canonial basic-Helix-Loop-Helix（bHLH）][8]，在水稻PCF DNA结合蛋白中也发现这种bHLH结构的存在[9]。

将含有这种保守结构域的转录因子定义为TCP转录因子家族拟南芥基因组编码了24个TCP转录因子其中TCP3能直接结合到miR164a的启动子，激活其表达[10]随后，在Dicer酶DCL1配合SE蛋白和HYL1蛋白的共同作用影响下，剪切植物的初级RNA演变为miRNA的前体物质pre-miRNA[1，11]Dicer酶是一种特殊的双链RNA专一性内切酶，针对特定的双链或茎环结构进行切割处理，进而获得长度为21 nt或22 nt的双链切割产物[12]自N末端开始，Dicer酶依次由RNA解旋酶结构、PAZ结构域、2个RNA降解催化区等多个结构构成[13]拟南芥中，已被发现的Dicer酶有4种，分别是DCL1、DCL2、DCL3、DCL4，用来加工花器官及叶片中的miRNA[14]随后在pre-miRNA上进行第2次剪切操作，从而获得对应的双链miRNA-miRNA*[15];这一双链在HEN1（miRNA甲基转移酶）的作用下，3′端末尾的核苷酸发生甲基化[16];甲基化之后，在HASTY蛋白的作用之下，将其自细胞核转运至细胞质[17];最后，双链裂解演变为2个单链，已经接近成熟的miRNA和靶基因之间进行整合，在AGO（Argonaute）蛋白的作用下，加入到RNA沉默复合体（RISC）的组装环节中，另外一个互补链（miRNA*）则大部分被降解，其中仅有较少的具备相关功能的部分被保存下来[18]。

AGO蛋白是一类庞大的蛋白质家族，是RISCs复合物的主要成员，其序列高度保守，是转录因子EIF2C的同源物[19]AGO蛋白主要包含2个结构域：PAZ结构域和PIWI结构域研究表明，PAZ结构域结合到siRNA的3′的二核苷酸突出端;一些AGO蛋白的PIWI结构域赋予slicer以内切酶的活性这2个结构域对于siRNA和目标mRNA相互作用，從而导致目标mRNA的切割或翻译抑制过程是必不可少的miRNA和转录因子一样，都属于参与基因表达调控的反式作用因子，通过与DNA结合来调节真核基因的转录miRNA与转录因子一样，具有基因表达调控的时空特异性，通过激活和阻遏特定基因的表达来决定细胞分化的方向miRNA的靶基因大多是转录因子基因，主要调控转录因子的表达，并且受转录因子的负调控，同时1个miRNA可有多个靶基因，例如拟南芥miR156及其靶基因SPL家族1.2.2 植物miRNA的作用机制在植物中，miRNA-RISC对靶基因mRNA的作用主要通过与靶基因完全互补结合，切断靶基因的mRNA分子，作用的方式和功能与siRNA（small interfering RNA）十分相似在miRNA的切割环节内，5′端的2～8位残基作为和靶mRNA存在互补效应的特殊元件，切割位点是miRNA第10～第11位所对应的靶mRNA的ORF区[20-21]。

miRNA的另一种作用方式为抑制靶基因的翻译发生这种作用时，miRNA与靶基因不完全结合，依靠调整靶mRNA中核糖体的数量或特异性地降解多肽进一步约束mRNA的翻译[22]这种作用方式在植物中较为少见但是互补程度与作用机制的关系并不绝对例如拟南芥miR172与转录因子APETALA2的ORF序列完全互补，但却是通过翻译抑制来调节其表达的[23]，甚至切割和抑制2种模式大多是彼此协同而进行调控的[24]此外，miRNA也可通过其他的模式来调控，例如通过与其他RNA竞争结合蛋白来实现靶基因的表达沉默[25]1.3 植物次生代谢与植物天然活性物质的简介植物次生代谢是相对于植物的初生代谢而言的，即植物利用初生代谢产物，在一系列酶的催化作用下，通过进一步合成或分解代谢，产生诸如生物碱、黄酮类、挥发油等物质此类代谢的基础定义最初源自于Kossel在1891年的分析，随着研究的不断深入，人们发现，此类产物尽管并非细胞活动的必备物质，但其在植物与生态环境的关系中充当了重要的角色，赋予植物环境适应性和防御等能力[26]同时，次生代谢产物具有较大的应用性，很多传统中草药的有效成分主要是植物的次生代谢产物例如生物碱有着抗菌、消炎以及抗癌等多方面的功能[27];黄酮类在抗菌、消炎以及抗艾滋病等方面有着显著的效果[28];植物酚酸类在清除氧自由基等方面有着良好的表现，进而可以优化循环和恢复控制损伤以及硬化等问题[29]。

此类药用植物的天然次级代谢活性物质对人类医学的发展有着重要的意义植物体内天然活性物质的次生代谢合成途径核心为：依靠甲羟基戊酸等方式来获得所需求的萜类物质;依靠醋酸-丙二酸等方式来获得脂肪酸类以及酚类等相关的物质;依靠氨基酸等方式来获得生物碱类;依靠桂皮酸等方式来获得苯丙素类及黄酮类化合物等等[30]这些代谢途径因为次生代谢产物具有多样性，其合成途径也极为复杂并且易受外界影响，所以次生代谢的过程具有复杂的调节机制，研究人员可依靠针对次生代谢合成的有效控制，从而调整此类代谢物的实际产出规模大量研究表明，植物miRNA的调控功能涉及到植物几乎所有的代谢过程，例如参与植物的生长阶段转变、器官形态的建成、对环境胁迫的应答和相关的次生代谢效应次生代谢使植物在长时间的进化过程中，对于生态环境产生适应性效果，在植物与生态环境之间的关系中发挥了显著的影响作用很多植物在面临病原以及恶劣的环境威胁的情况下，会生成并且同时积累大量的次生代谢产物，以此来获得更具有适应性的免疫力以及抵抗力而且相关的代谢途径涉及到许多转录因子、植物激素以及酶的调控近些年关于该领域的众多试验结果表明，miRNA可通过靶向作用植物次生代谢途径中的转录因子或关键酶的基因来调控植物次生代谢产物的合成过程。

本文将结合miRNA的合成调控及其生物学功能，主要介绍目前已报道的部分植物miRNA在植物次生代谢合成调控过程中的作用2 植物miRNA参与调控植物次生代谢产物的生物合成2.1 miRNA对拟南芥次生代谢途径的调控作用研究表明，模式植物拟南芥中主要存在着以下几类miRNA所介导的天然活性化合物的代谢合成调控现象，它们有些直接作用于靶向合成酶基因及轉录因子，有些则通过间接调控植物激素合成及其信号传导来介导次生代谢的途径花青素（anthocyanidins）是自然界中一类广泛存在于植物体内的水溶性天然色素，具有向顶性，通常在植物的叶子和茎中积累，能够反映光照量及营养水平花青素和黄酮醇都是酚类化合物，由苯丙氨酸通过苯丙烷素类合成途径合成而来二氢黄酮醇是两者的共同中间前体物质二氢黄酮醇由黄酮醇合成酶催化生成黄酮醇;由二羟黄酮醇4-还原酶催化则生成花青素拟南芥中，花青素的积累受miR156及其靶基因SPL9的负调控在miR156活性高的情况下，花器官以及茎的连接位置存在较多的花青素;miR156活性低的情况下，其中的花青素会急剧减少，黄酮醇则高水平积累试验证实，转录因子SPL9依靠和TT8（Transparent Testa 8）竞争结合PAP1（production of anthocyanin pigment 1）从而限制MYB-BHLH-WD40转录复合体的演变，进一步控制花青素合成基因DRF（dihydroflavonol refuctase）的表达，负调控花青素的合成[31]。

拟南芥中另一保守的miRNA-miR828靶向作用TAS4（transacting siRNA gene4）和MYB113源自TAS4的 ta-siRNA的靶向PAP1、PAP2、MYB113蛋白均属于MYB转录的基础构成之一，加入到控制黄酮类等产物的合成过程中[32]miRNA通过直接作用于靶向合成酶基因及转录因子来调控拟南芥中花青素以及黄酮醇的积累拟南芥miR163是新近进化的miRNA，在拟南芥中表达量很高miR163靶向参与次生代谢途径的甲基转移酶SABATH家族蛋白基因的表达调控，包括水杨酸羧基甲基转移酶（sa。