Sry核酸免疫对小鼠性别决定的影响.pdf

摘要哺乳动物的性别发育过程分为两步：第一步“性别决定”，由基因决定原始性腺发育成睾丸或者卵巢；第二步“陛别分化”，在睾丸或卵巢产生的不同激素作用下最终形成雄性或雌性表现型性别决定是性别分化和继续发育的前提，受睾丸决定因子S R Y ／S r y 的启动，小鼠的性别决定发生在交配后的1 0 ．5d ～1 2 ．5d ，S t y 恰好只在此时表达但是性别决定是一个短时而复杂的过程，还需要其它基因( 矿”、．s 产J 、S O X 3 、S O X 9 ，』e l l S 和删卜J 等)的参与，S R Y ／S r y 在其中处于核心地位，因为它对性别决定起到开关作用现已有很多实验室都通过不同的转基因技术得到了S t yX X 雄性转基因小鼠，本实验室也曾采用精子介导技术实现了外源S t y 基因向胚胎的导入，并得到子代性别比例向雄性的显著偏移同时也有研究通过基因敲除或在S t yH M G 盒中制造点突变实现x Y 雌性的性反转，证实了S r y 基因在性别决定中的关键作用然而，以上技术距离生产实践的应用还有相当长的距离，截至目前尚未见到使用核酸免疫学方法控制哺乳动物性别发育的研究，本课题则创新性地利用核酸免疫技术遏制了胚胎时期S t y 的作用途径，成功地获得了X Y 雌性性反转个体。

首先构建并检测重组的真核表达载体p C R 3 ．1 一S t y ，大量提取该质粒制备核酸疫苗并控制其浓度和纯度，通过肌肉注射免疫性成熟的母鼠，使母体产生抗S R Y 蛋白的抗体并穿过胎盘屏障影响其胚胎，抗S R Y 蛋白的抗体有效的结合了胚胎期表达的S R Y 从而阻遏其对下游基因应有的作用，最终切断中性性腺脊向雄性的发育通路，实现了X Y 雌性的性别反转免疫后的母鼠共有1 5 只生仔，子代小鼠的性别比例( 6 ：早) 为1 ：1 ．1 1 ( P 型蛋岛$ H W T l ( 一K T S ) 黧蛋宣缀多磷究显示：W T l ( - K T S ) 黧獭岛霹敷簿菇瓣结合富禽G C 停3 D N A 模块‘“1 ：w r l 上存在两种功能区，现在可以糕本确定位于8 5 —1 2 4 的抑制区和位于i 8 l 一2 5 0 豹激滔区o “，两个区域的幸# 用是各自独立的；孵l 的D N A 结合活性可能熙通过锌携结梅束实现熊；W T l ( + K T S ) 型蛋自可懿与某些m R N A 萃蟊赘接因子缩合，提示它可能参与基因转录后水平的调节；+ K T S 年I - K T S 型W T l 强白的比例谯人、小鼠和大鼠的发育过程中基本保持在1 ：l ，隧卷比例失调将会出现发窘髯鬻。

嗣酊已经发琥了多个陡剐发育的关键基因受瓣W T l 的调控，包括S R Y ／S r y0 s e x —d e t e r m i n i n gr e g Jo no n 、g e n e 、、S F —l ／s f —lt t h eg e n ee n c o d i n gs t e r o i d o g e n i Cf a c t o r —1 ) 、M t S ／M i s( M u l l e r i a n —i n h i b i t i n gs u b s t a n c e ) 和删舅～1 ／D 墨x 一』( D S S[ d o s a g e —s e n s i t i v eS e Xr e v e r s a l ] 一A H C [ a d r e n a lh y p o p l a s i ac o n g e n i t a 】c r i t i c a lr e g i o nO nXc h r o m o s o m eg e n e1 ) l ，2 ．S F _ 1 ( s e r t o i d o f e n i cf a c t o r - 1 )S F - I 是一种孤核受体蛋白，内分泌发育的介导者，此家族可介导甾类激素、甲状腺豢、维生黎D 、视黄酸的作用，在肾上腺、性腺等合成甾体激素的组织中均肖表达。

影聪E 性豫中瓣表达具有性刚二态性，当，I 、鼠中疑瑟形残晷殖窦霹( 受精蜃9 —9 5天) ，S f - 1 就开始在两性胚胎中表达，在E 1 2 ．5 2 _ 前，箕液达水平在两性之间没有明最差异当雄性小鼠的曲细精管开始分化时，即1 2 ．5 —1 5 ，5 r 一』在s e r t o l i 细胞中表达达到瀚峰，焉戆鼹爨巢中剩醛低这静翼寸闼秘往弱上匏表达差异与M I S 袭这( 雄性生建鸯E i i 5 开始，而雌性卵泡出生后才表达) 及缪勒式管的退化一致基因敲除的小鼠缺乏性腺、肾上腺，却有输卵管、子宫、阴道等缪勒氏管演化器官这表明s P —l 的胚胎早期维持性腺形成，随磊调节攀丸藏墨豹表达”s F ～l 蛋自在体外能与M I S 基因的上游序列相结合，并且在共转染分析中活跃转录，近来发现S F ～1 也结合D a x 一1 基因的扁动子，诱导其转录人类的萨J ( 位于染色体9 q 3 3 ) 突变至今还没有礤究，毽因为夫熬S F - I 与鼠S 产j 毒广泛戆嚣滚淫显表达豹缝绥分毒鞠阉，故推测人剐．_ 』的功能可能与小鼠5 产，相似4 ．2 ．在性别决定时期作用的基因4 2 ．1 ，s o x a N S O X 9人类及小鼠中已发现的S O X 綦阑多达2 4 种““，其中s o x 3 楚唯一一个位于x 染色体的S O x 家旅基因，与S R Y 的同源性最商。

1 ；s o x g - 与性别决定直接相关，可能魁S R Y 的下游基因S O X 3 ( S R Y —li k e 戮Gb o xc o n t a i n i n gg e n e 一3 ) 在辩经系统套籁狳泌暴生疆脊熬发育中超作用已经证明人类中S O Y 3 定- 位于X q 2 7 ，小鼠中S O X 3 定位于x 染甑体上最保守的区段内’但由于在生殖嵴中未检出斯粕的表达，并已发现了X 染色体缺失包含．∞E z i 笙内的5 M b J 4羧瞧是美骞舅魏表鍪熬瘸骥，霆魏S O Y 3 露Y 瞧并不壹按参与缝巍浃是但是受强≥熬困麓失活将导致x x 男性；s o x 3 的复制和过量表达不会影响x x 的胚胎女性表型，但会产生x Y 性反转女 性这些现象提示删恿过间接抑制雄性性腺的形成参与哺乳动物的性剐决定S O X 9 ( S R Y 一1 i k el 鼹b o xc o n t a i n i n gg e n e 一9 ) ，遨一基困爨编碣麓蛋自蒺冀有与S R Y鬣白相{ 炯D N A 结合结构域，作用机制也栩似，但是H M G 区域以外的结构与鲫趿戴他S O X 基因却不相同，但是不同种属的脊椎动物间却有高度的嗣源性表明其舆有重要的功能吲。

S O X 9瓣保守往存套予双鱼类裂骥虢动凌中，毽雅往特异瞧表遮豹S O X 9 灵在哺乳动物籀鸟类中存在8 ”3 c D 患者( c a m p o m e l i c d y s p l a s i a ) 是一种罕见但通常致死的先天性的骨骼发育异常综合征，伴有骨髂畸形且在已报道的5 0 例患者@ 2 ／3 以上表型为女性，而且性腺发育异常强麓夫弱鬟凄是位子1 7 q 弱s o x g K ￡西藏怒C 9 萋函8 1 小鼠胚胎早期＆痂E 达之前两性的性腺脊均有∞臌达，当雄性小鼠＆调i 达到高峰之 厝，s o x 蚴U 也达到峰值，E 1 2 ．5 后仅见于s e r t o l i 细胞并持续赢水平淡达，雌性则在E 1 1 5消失，诧褒象表鞠，S O X 9 - 毒瞧别分诧直藏鞠关4 ．2 ．2 ．D A X 一1 ( D S S —A H Cc r i t i c a lr e g i o n0 nt h eXc h r o m o s o m eg e n e - 1 )早期，B a r d o n i 等在X p 2 1 定位了一个参与性别决定匏基因座D S S ( d o s a g e - s e n s i t i r es e x r e v e r s a l ，潮量敏感往瞧反转基因) ，长1 6 0 k b ，虢邻先天性肾上腺发育不全( a d r e n a lh y —p o p l a s i ac o n g e n i t a ，A H C ) 基因座8 ’。

具有一个完憋的S R Y 基因并且X p 2 1 - 2 2 区有·一个重复的病人具有女性表型后来，从这一区域中克隆到了占匝卜』( D S S —A H Cc r i t i c a lr e g i ( mO nt h eXc h r o m o s o m eg e n e —1 ) ，由于它与A H C 有关两褥名删卜，被认为是卵巢分化撼因，其蛋白属于核激素受体超家族，其缺失导致的肾上腺发育受睚和性腺机能下降等性状与铲，基圆敲除小鼠的液型耱戗，裘明1 3 , 4 X - 1 秘S F - 1 可畿饶予发育的潮～途径中，谢且两者在许多相同魏位鬻表达：如幢腺、肾上腺皮磺、艨垂体促性腺激素细胞等”9 】是否发生性别反转与这个蒸因表达鲍承平和时闻密切稷关，这个蒸因静功能缺失型突变并不会影确x Y 氍胚胎的发育，但是，功麓得到型突变将会导致x Y 罐性的性剐反转对于 其作用机制，后期研究有所提示：删肌和蹴同一时间液达，但是与黟向i 同的遐，删』一』在x x , H x Y @ 都有表达，随着睾丸的发育，其淡达受到抑制，但是在卵巢的发育过程中始终表达：删卜』表达过度或者其高蜂出现在S R Y 离峰之前则可能克I 艮S R Y 的抑制作用，引起性反转。

S w a i n 等建立了转基因，l 、鼠模鼙，将蒯乒j 基因转染入x Y 惩骆，发现离求平多} 源往删』一』袭达对正常S ，谱位基因小鼠只能起到延迟睾丸分化的作用，而在- S 砂等位基因较弱时彳‘可能导致完全瓣性别反转3 + 在性剐分纯簇怒作用的M I S删罐因缺陷的小鼠有睾丸，可以形成有功能的精子，但是同时也具有雌性生殖器；如果擎丸雌性化突变秘舟! 括基因缺翳嗣时存在，将会导致两种雄性分化过程中很重要的激素功麓使失，个体将发育为难往，肖子富、输卵管等雌性生越器，除了睾丸没有萁饨瓣往生殖器，而睾丸也是有功能障碍的o ”此性别发育异常提示，M I S 在性腺分化过程中怒着一定的调节{ 乍嗣遴一步实验表蹈：小鼠前s e r t o l i 细胞的M I S 合成出现在S R Y 产物表达后的2 0 b # 将S R Y表达质粒与∥乃宿动子转染到培养的早期性腺组织，发现S R Y 与埘骟动予的转录活性相关：搿，j 獭始区( 一2 2 ～十8 ) 可奔导S R Y 诱导豹转录，该区豹突变会簿低转最溪性但是势没有发现S R Y 与M I S 直接结合5 ’问时，M I S 扁渤予一8 4 ～一1 0 3 区域的M 2 ／M I S - R E l 位点禽有C C A A ( ；G T c A 序列，为S F 一1 结合区，这个区域的突变导致s e r t o l i 细胞系报告基因表达降低。

5 影瞧涟爨决定弱其毽嚣素5 ．1 ．剂量补偿剂量补偿是使x 连锁的基因在两性间的表达水平达到平衡的过程，真兽监纲哺乳动物的裁羹{ } 缮瓿铡是戆娥失活避蛙秘耪题条x 染镌转中数一条残在认为x 失溪单独峦X 凌憩{ 奉上的一个称为x 染色体失活中心( Xi n a c t i v a t i o nc e n t e r ，X I C ／X i c ) 的顺式作用开关区域摔制丌始于X I C ，然后扩展剐整个染色体，人X I C 定位于X q l 3 ，小鼠X i c 定位于x D ，这两个携耪闽数x I C 蒸遴窿功麓一敬这是迄今发麓戆唯一一个稷毂奎失瀵豹X 表这戆基因，冈而成为X i C ／X i c 的强烈候选者”j 5 ．2 ．基因剂量。