反相高效液相色谱法测定食用植物油中维生素E的含量.docx

反相高效液相色谱法测定食用植物油中维生素 E 的含量摘要:，高效液相色谱法、6-生育酚、Y-生育酚、a-生育酚关键词:维生素E 第一章 绪论1 选题的目的和意义维生素E是具有a -生育酚生物活性的生育酚和三烯生育酚及其衍生物的总 称它们都是苯并二氢吡喃的衍生物2 高效液相色谱法简介3 国内外研究进展4 主要研究内容第二章高效液相色谱法色谱条件的优化引言由于维生素E结构复杂，异构 体种类多，分析测定相对困难，现已知的分析方法有气相色谱法、紫外分光光度计 法、电化学分析法、比色法、荧光法、前面几种方法大都需要较复杂的样品前处理过程，增加了试高效液相色谱法 等验难度，而且测定的结果受到多种因素的影响高效液相色谱法是近年来发展起来的一种分析技术，用来分析维生素E能简化样品处理的步骤，相较其他方法具 有色谱柱温度条件相对温和，物质组分分离速度快，灵敏度高，重复性好，干扰小 等优点，明显优于其他几种检测方法，成为实际检验工作中测定VE最普遍的方 法高效液相色谱法又分为正相色谱法及反相色谱法正相色谱法的流动相大多为 有毒有害的且易挥发的有机溶剂，故一般采用反相色谱柱进行分析反相键合相色 谱是在ODS(C)柱上，采用甲醇-水或者乙腈-水作流动相，分离非18极性或中等极性的化合物如同系物，稠环芳烃、药物、急速、天然产物及农药 残[1]留量等。

色谱柱的稳定性比较高，保留时间短，重现性好，容易平衡等优 点，而且一般以水和甲醇作为流动相，减少了有毒有害溶剂的使用在高效液相色 谱中，影响分离效果的好坏的其中一个重要指标是色谱填料的选择，反相色谱用的 填料通常是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱官能团的键合相反相色谱所 使用的流动性极性较强，通常为水、缓冲溶液与甲醇、乙腈等的混合物样品流出 色谱柱的顺序是极性较强的组分最先被冲洗出，而极性弱的组分会在色谱柱上有更 强的保留常用的反相填料由：C (ODS),C(MOS),C(Butyl)、CH188465(Phenyl)等本试验选用的是C色谱柱紫外吸收检测器是一种选择性的浓18度型检测器，是HPLC中应用最早、最广泛的检测器之一，原理是通过测定物 质在流动池中吸收紫外光的大小确定其含量，优点是不仅灵敏度高和选择性高，而 且对环境温度、流动相的流速波动和组成变化不敏感试验时选用的紫外检测器目前有相关标准及文献介绍了 VE的测定方法，但是色谱条件各不一样本试验 根据以下相关标准及文献的色谱条件选取合适的水平进行试验分析，对波长、流动 相比例、柱温、流速做单因素实验从而选取每个因素的三个最佳水平进行试验设 计。

分离度为色谱柱的总分离效能指标，既反映柱效率又能反映选择性，其定义为 相邻两组分的色谱峰保留值之差与峰底宽总和一半的比值本试验测定维生素E的 三种单体，观察色谱图可知，三种单体的色谱峰都能完全分离，峰形尖细，故以色谱峰的保留时间来定性峰面积来定量，选用第一个色谱峰出峰 时间及VE三种单体色谱峰的峰面积作为评定值，以确定测定维生素E的最佳色谱 条件即第一个单体保留时间最短，峰面积响应值最大初始色谱条件为：紫外检测 波长300nm，流动相为甲醇+水=98+2，流速l.Oml/min,柱温30?，进样量10ul 相关标准及文献VE测定色谱条件比较如表1所示表1 色谱条件比较标准及文献 紫外检测器波长 流动相比例 柱温 流速 NY/T 1598-2008 300nm 甲醇+水=98+2 30? 未规定 GB/T 5009.82-2003 300nm 甲醇+水=98+2 未规定 1.7ml/min GB/T 17812-2008 280nm 甲醇+水=95+5 室温 1.0ml/min GB/T 9695.30-2008 292nm 甲醇 30? 1.0ml/min GB/T 5413.9-2010 294nm 甲醇 35??1? 1.0ml/min [2]文献2 荧光检测器 甲醇+水=98+2 35? 1.0ml/min [3]文献3 292nm 甲醇+水=98+2 40? 1.0ml/min [4]文献 4 298nm 甲醇+水=99+1 25? 1.7ml/min [5] 文献5 荧光检测器 甲醇+水=98+2 室温 0.8ml/min 1 材料与方法1.1 材料与仪器1.1.1 化学试剂甲醇高效液相色谱淋洗剂HPLC国药集团化学试剂有限公司乙醇(无水乙醇) 优级纯 国药集团化学试剂有限公司 无水乙醚 分析纯 衡阳市凯信化工试剂有限公 司 硝酸银 分析纯 国药集团化学试剂有限公司碘化钾 分析纯 国药集团化学试剂有限公司氢氧化钠 分析纯 国药集团化学试剂有限公司硫代硫酸钠 分析纯 国药集团化学试剂有限公司氨水分析纯衡阳市凯信化工试剂有限公司gamma-Tocopherol 25mg - Neat SUPELCO Analytical delta-Tocopherol lOOmg - Neat SUPELCO Analytical DL- alpha Tocopherol lOOmg - Neat SUPELCO Analytical 1.1.2 试剂的处理无水乙醚:检查是否含有过氧化物，检查方法:吸取5ml乙醚加入lmllO%的碘化 钾溶液(100g/L)，震摇lmin，水层呈现黄色，则该乙醚需处理后使用。

去除过氧 化物的方法：乙醚加入一定量的硫代硫酸钠(50g/L )于梨形分液漏斗中震摇，静置， 分取乙醚层，然后再用蒸馏水洗涤乙醚层2次，于水浴上蒸馏，弃去首尾蒸出的部 分，收集馏出液，然后再次检查，直至不含过氧化物无水乙醇:检查是否含有醛类物质，方法：加一定量的氨水于硝酸银溶液(50g/L) 中，直至生成的沉淀重新溶解，再加入几滴氢氧化钠溶液(100g/L)，如再产生沉 淀，则再加入氨水直至沉淀消失，此溶液则为银氨溶液吸取2ml银氨溶液于干净 试管中，加入0・5ml乙醇，摇匀，再加入几滴氢氧化钠溶液(100g/L)，于沸水浴上 加热，放置冷却后，试管壁出现少量片状银镜，则乙醇需经过处理后使用脱醛方 法:称取4g硝酸银溶解于少量水中，称取8g氢氧化钠溶于温热的乙醇中，然后将 两者倒入1L的乙醇中，充分震摇后，放置暗处2d(期间不时摇动)，过滤后，于水 浴中蒸馏，弃去初滤液，收集滤液，然后再检查1.1.3 仪器与设备Waters高效液相色谱仪e2695配2489紫外检测器 美国沃特斯有限公司 色谱 柱 C 柱(150mmX4.6mm，5um) 181.2 试验方法1.2.1 标准溶液的配制天然维生素E同系物通常为透明、淡黄色粘稠油状物，无臭无味，比重为 0.950(25?)，不溶于水，可溶于油、丙酮、乙醇、三氯甲烷和乙醚等脂溶［8］性溶 剂。

因为乙醇要进行脱醛处理，故选择甲醇配制标准溶液将100mg6-生育酚、 100mga-生育酚、25mg 丫-生育酚用甲醇分别定容至100ml、100ml、50ml棕色容量 瓶中，将其作为1mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml的储备液，放置冰箱保存；移取一定体积的三种生育酚储备液，配制成1mg/ml、10mg/ml，40ug/ml， 60mg/ml， 100mg/ml， 140mg/ml的浓度梯度的混合标准溶液1.2.2 单因素试验1.2.2(1 波长的确定试验以色谱条件为流动相：甲醇+水(V+V)=98+2,柱温:30?，流速：1.0ml/min.，在紫外检测波长为280nm、290nm、292nm、294nm、300nm条件下进样量10uL做单因素试验1.2.2.2 流动相比例的确定试验以色谱条件为紫外检测波长300nm，柱温:30?，流速：1.0ml/min，进样，在流动相甲醇和水的比例为95:5、97:3、98:2、99:1、100:0条件下量10uL做单因素实验1.2.2.3 流速的确定试验因为柱效是色谱柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可以得到不同的 柱效对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。

对内径 4.6mm的色谱柱，流速一般选择lml/min,对于内径为4.0mm柱，流速0.8ml/min 为佳故综合文献及流速对柱效的影响，选择以下5个水平做单因素试验以色谱 条件为流动相：甲醇+水(V+V)=98+2，柱温:30?，紫外检测波长300nm，进样量 10uL，在流速为0.8、0.9、1.0、1.5、1.7ml/min条件下做单因素试验1.2.2.4 柱温的确定试验因为C柱推荐使用柱温为40?，最高使用温度为50?，故以色谱条件为18流动相：甲醇+水(V+V)=98+2,紫外检测波长:300nm，流速：1.0ml/min,进样量10uL，在柱温为25?、30?、35?、40?、45?条件下做单因素试验1.2.3色谱条 件优化试验响应面法可以很好的反应各因素的与响应值之间的关系以及各因素之间的交互 作用，借用其他统计软件还可以精确的预测最优工艺参数及其对应的响应值，但根 据单因素结果可以看出，因素水平与评定值之间的关系大多为一定的递增或者递减 趋势而不是有起落的峰形图，所做出的响应面液不是屋脊面，故本试验采用正交试 验方法正交试验的结果分析有直观分析和方差分析2种，虽然直观分析法简便易 懂，但是不能对试验结果中必然存在的误差大小予以无偏估计，不能确定其精确度，因而给试验的分析带来困难。

方差分析法要求用正交表设计［6］试验时，必须 留有不排入因素或互作的空列以作为误差的估计值，故选取流动 4 相比例、流速、 柱温三个因素的三个最佳水平做L(3)正交试验，重复次数为92 次，确定最佳色谱条件2 结果与分析2.1 单因素试验结果2.1(1 波长单因素试验结果如图1所示1460000013.9500000delta 色谱峰保留时 13.8400000 间(分钟)13.7300000(delta+gamma+alpha)色谱峰峰面积(微 13.6200000 伏*秒)13.510000013.40波长 280nm波长 290nm ■幽皿*口冈郦；门山；naia-niwi 1 惘电時 cm Ctm fu^uiiiiij iMTTQ逐T17 ifi -f/EimDHMflE *（对Mih*・=2怕¥itf j, inMt±on ]. QbMRai 帕4齒 Oik akm all Hl 祐创 3UH d^T.岸羊禅呗隔切叨刊I .订＞：却叶1.⑷.工费zh齢L 口⑷ d raU'*.i SA. E匕開皿胡2IJTI-3-2 I!im, JUu^-n|P- 匸V_?〕e 山壬」巾]9心.I UhJJic^ ^'r-ISii dzA Ln*=i. ^±iir ^1J JD 11-3-d I 帰应盯居T3at Hii^n-f- *|hjQ -i|| r iirrn m 7： l|i|KDnn 1〔Td 阳前 口 比 Gd・耳C押呵胡 11TE1 1^20*e?WT波长 292nm波长 294nm波长 300nm图 1 不同波长的比较分析:根据文献知维生素E的最大吸收波长基本均在280nm-300nm，由表中数据 可见在不同波长条件下保留时间基本不变，只有色谱峰峰面积在变化，波长 294nm 时峰面积最大；由图知不同生育酚单体有不同的最大吸收波长，a-生育酚色谱峰的 峰面积变化最明显，波长为290nm, 292nm, 294nm时a-生育酚的峰面积相差不 大，最终选取 294nm 做为紫外检测器的波长。

2.1.2 流动相比例单因素试验结果如图 2 所示3060000025500000delta色谱峰保留时20400000间（分钟）15300000（de l。