非洲猪瘟一周年了,疫苗研发进展.doc

非瘟一周年了，疫苗研发取得哪些进展？基因缺失疫苗是短期内最有希望的疫苗非洲猪瘟(African Swine fever ，ASF )是 由非洲猪瘟病毒(ASFV )感 染家猪 和野猪引起一种急性、出血性、烈性传染病，还有可能引起重大的社会经济 问题世界动物卫生组织(OIE )将其列为法定报告动物疫病，也是我国重点 防范的一类动物疫情ASF已初步呈现出全球流行趋势，2018年8月进入中 国中国是世界养猪最多的国家，ASF成为了我国养猪业的重大威胁非洲猪瘟病毒(ASFV )是一种大的、复杂的虹形病毒，该病毒基因组包括一 个线性的双链DNA分子，根据病毒株的不同，其大小约为170〜190kb，整个 DNA序列两条链包含约151到167个开放阅读框由于非洲猪瘟病毒基因型 的多样性，且遗传信息数量巨大，具有复杂多样的免疫逃逸机制，可以不受 宿主免疫细胞的作用，即使疫苗产生一定水平的抗体，仍不具备杀死或者抑 制非洲猪瘟病毒的能力使得科学家不得不多角度开展疫苗的研制工作，包 括灭活疫苗、亚单位疫苗、核酸疫苗、病毒活载体疫苗和弱毒疫苗等本文概述了各种疫苗的最新研究进展：一、 灭活疫苗ASF灭活疫苗是最先开始尝试研究的，包括病毒接种肺泡巨噬细胞以及感染 脾组织后匀浆，经加热、复方碘溶液、甲苯、福尔马林、结晶紫、4丙内酯、 乙酰氮丙啶和缩水甘油醛等物理、化学处理的ASFV灭活疫苗，虽部分能刺 激猪产生抗体，仍无法抵御ASFV的攻击。

Biome 等于2014年利用最新的佐 剂PolygenTM/Emulsigen?-D 和制备 技术对ASF灭活疫苗进行了重新评估， 免疫的猪只模拟自然感染采用了较高的攻毒剂量(109 TCID50/mL )，用强毒 攻击后可产生ASFV特异性抗体，但很快出现了急性临床症状，表现为发病， 几乎无效鉴于现有研究结果，采用传统方法研制有效的ASF灭活疫苗困难 很大二、 亚单位疫苗ASF亚单位疫苗只包含特定的病毒抗原，需通过合适抗原传递系统免疫动物 选择具有保护作用的抗原基因(p72、p54、p30、CD2v),利用杆状病毒系统 进行表达使用p54和p30共同免疫猪只，可以提供部分的保护作用然而 当使用p72、p54、p30共同免疫时却不能提供保护作用利用杆状病毒表达 的CD2v可以诱导针对ASFV强毒株的部分保护说明仅仅依靠上述抗原刺 激产生的中和抗体很难获得理想的免疫保护效果在另一组研究中， Lopera-Madrid 等分别 以人源 293( HEK )细胞表达的 ASFV B646L (p72) 、E183L(p54)和O61R (p12)亚单位抗原，或者痘苗病毒载体疫苗进行首免和加强免疫, 获得较好的体液免疫和细胞免疫水平。

因此，还需要研究鉴定更多的ASFV 保护性抗原、开发新型免疫佐剂，以及采用DNA首免蛋白质加强免疫策略， 以提高ASF基因工程亚单位疫苗的免疫效力三、 核酸疫苗(DNA疫苗)通过将编码病毒主要抗原的基因克隆入真核表达载体后，直接导入机体内， 在宿主细胞内完成转录翻译后产生抗原蛋白，从而同时激活体液免疫和细胞 免疫应答最新研究表明，根据一个或两个ASFV抗原构建的DNA疫苗并不 能诱导较高免疫 保护 ，而免疫 ASFV 基因组 DNA 质 粒表达 文库能 够提供 60% 的保护力，说明有待于发掘更多保护性抗原，以提高核酸疫苗的保护水平四、病毒活载体疫苗 目前集中在诱导免疫应答方面，通过选用痘病毒、腺病毒、伪狂犬病病毒等 载体，表达 ASFV 保护性抗原基因(p72、p54、p30、CD2v、p12、EP153R), 使用“鸡尾酒”式 混合免 疫或者 加强免疫策 略， 结 果发现 ， 免 疫猪只 可以产 生 特异性抗体和CTL (细胞毒性T淋巴细胞)反应2016年美国德克萨斯A&M 大学( 旧译为“德州农工大学”) 兽 医病理 学系研究人 员， 将 非洲猪瘟病毒抗 原基因重组入复制缺陷型腺病毒载体， 通过混合免疫后能够诱导体液免疫反 应和细胞免疫应答， 但仍需通过攻毒保护试验， 进一步验证其可行性。

五、 减毒活疫苗 目前有三种减毒形式：传代致弱毒株、 天然致弱毒株、 人工基因缺失致弱毒 株1、 传代致弱毒株ASFV 可经过猪骨髓来源细胞、 Vero 和 COS-1 等细胞系传代致弱 传代过程 中， ASFV 致病力逐渐下降， 同时病毒免疫原性和稳定性也随之下降 在西 班牙和葡萄牙， 使用传代致弱毒株免疫动物后产生了灾难性的后果， 免疫动 物呈现出肺炎、 流产和死亡等副作用， 在田间多次感染和异源强毒株存在的 条件下，许 多免疫动物呈现 ASF 慢性感染临床症状因 此，传 代致弱毒株的 致病性导致此类疫苗的开发一度受阻 Krug 等利用分离株 ASFV-G 在 Vero 细胞中进行传代培养，随着传代次数的增加， ASFV-G 在 Vero 细胞中的复制 能力增强， 同时在猪原代巨噬细胞中的复制能力下降， 病毒毒力逐渐衰减， 在传至第 110 代 时完 全丧失 家猪接种完全致弱的 ASFV-G 毒株 后并未 获得 相应保护力， 不能抵抗母本病毒的攻击， 表明传代致弱的 ASFV 安全性较差 且很难提供较好免疫保护2、 天然致弱毒株 从软蜱及慢性感染猪只体内分离到了一些天然弱毒株 OURT88/3 或 NH/P68 免疫动物后， 能诱导产生对同源强毒株的攻毒保护， 由于免疫途径、 免疫剂 量、 攻毒株的不同， 保护率介于 66%~100% 。

研究表明， 病毒特异性抗体以 及 CD8+T 细胞在免疫保护中均起重要作用，且 OURT88/3 毒株产生的免疫保 护与病毒特异性IFN- y产生细胞呈正相关性采用NH/P68免疫后，猪对高毒 力 ASFV/L60 感染抵抗力增强 以 OURT88/3 免疫并用致病性 OURT88/1 毒 株进行加强免疫后， 可诱导机体产生针对 ASFV I 型不同分离毒株的交叉保 护， 表明研制具有交叉保护的 ASFV 疫苗是可能的 然而， 天然致弱毒株免 疫动物后可造成诸多副反应， 包括肺炎、 流产、 死亡等， 免疫 NH/P68 毒株 后 25%~47% 的猪呈现慢性感染；免疫 OURT88/3 后可导致发热、关节肿胀等 症状 总之， 天然致弱毒株导致的诸多副反应， 以及存在散毒的可能性等生 物安全隐患， 限制了其在实际生产中的进一步应用3、 基因缺失疫苗采用分子生物学方法， 敲除 ASFV 强毒株或者弱毒株的病毒功能基因、 病毒 毒力基因或者免疫抑制基因，可降低病毒毒力或增加机体对病毒的免疫应答， 研制比传统弱毒疫苗安全性更好且效力更高的基因工程减毒活疫苗 一些 ASFV 毒株在缺失单个或多个毒力基因或免疫抑制基因后，如 TK(K196R)、 9GL(B119L )、 CD2v(EP402R)、 DP148R 、 NL(DP71L)、 UK(DP96R) 和多基因家族 360 和 505 （ MGF 360/505 ），缺 失毒 株接种宿主毒 力减弱且可 诱导产生针对同源母本毒株或异源毒株的特异性免疫保护，大部分基因缺失 疫苗的保护率可高达 100%，免疫后可以抵抗亲本毒株的攻击，具 有同源保护 作用；有的可以抵抗异源毒株的攻击，即具有异源保护作用，但也有一些候 选株保护效力下降，甚至无保护作用。

BA71毒株缺失CD2v基因后对基因I 型和□型ASFV均能提供完全保护，具有交叉保护作用，未来开发前景较大 基因缺失疫苗可以提供完全保护， 但却存在残余毒力， 免疫后可引起亚临床 症状和病毒血症等问题， 阻碍了其商业化进程， 是需要着力解决的问题 目前的 ASF 疫苗都不尽人意， 灭活苗几乎无效；而亚单位疫苗、核酸疫苗、 病毒活载体疫苗的保护效力偏低， 需要对 ASFV 的免疫应答机制进行深入研 究 瓶颈是不清楚可诱导完全保护的病毒抗原（蛋白）， 鉴定保护性抗原基 因， 解析 ASFV 免疫保护的分子机制， 同时需要研发高效的抗原递送系统， 以诱导产生高水平的 ASFV 特异性抗体， 提高疫苗的保护率 ASF 疫苗研究 主要集中在减毒活疫苗和基因缺失疫苗， 非洲猪瘟基因缺失疫苗可以提供完 全保护， 是短期内最有希望的疫苗， 其安全性可以通过进一步缺失毒力或免 疫抑制相关基因 来解 决目前全球至少8个国家15个研究机构正致力于非洲猪瘟疫苗研发， 2017年 底，欧盟发起了针对非洲猪瘟疫苗的创新行动 2018 年 3月底，西 班牙的科 学家在 Vaccine 杂志上发表研究他们以毒株 NH/P68 为骨架，研制了缺失某些 特定基因的弱毒活疫苗， 能够有效防控非洲猪瘟病毒感染， 下一步将研究如 何提高该弱毒疫苗的安全性和有效性。

2018 年10月 15日，美国农业研究局 将授予Zoetis （硕腾）有限责任公司独家使用 基于MGF基因缺失的减毒非 洲猪瘟疫苗”的专利 2019 年 3月 22日， 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 国家非洲猪瘟专业实验室发表的最新成果，研究人员利用 2018年 9月3日黑 龙江省佳木斯疫情发病猪样品， 接种猪原代肺泡巨噬细胞， 成功分离出 Pig/HLJ/18 进行了较为系统的研究，继而开展病原学关于感染性、致病力和 传播能力等生物学特性研究和动物病例研究， 并建立了动物感染模型， 去年 12 月初实验已经完 成但是要进行疫苗商品化还需进行：种毒毒力基因鉴定模型，找到ASF疫苗生 产细胞系， 确定在细胞或猪体内遗传稳定， 区别野毒感染与疫苗免疫的鉴别 诊断方法，在 ABSL3 以上实验室进行疫苗评价相关试验等工作鉴于以上原 因， 非洲猪瘟在短期内仍然不会有商品化疫苗出现， 因此生物安全仍然是控 制该病的最优措 施。