《基因克隆的载体》PPT课件.ppt

基基因因工工程程张张锐锐第二节第二节 基因克隆的载体基因克隆的载体 载体的概念及特点载体的概念及特点 质粒载体（质粒载体（plasimid vectors） 噬菌体载体（噬菌体载体（phage vectors） 柯斯质粒载体（柯斯质粒载体（cosmid vectors） 引引 言言载体（载体（vector）：能携带目的基因进入宿主细胞进行）：能携带目的基因进入宿主细胞进行 扩增和表达的工具扩增和表达的工具作为基因克隆的载体必须具备以下特性：作为基因克隆的载体必须具备以下特性：A.能在寄主细胞中进行独立的复制和表达；能在寄主细胞中进行独立的复制和表达；B.具有具有1-2个选择标记基因，如对抗生素的抗性基因个选择标记基因，如对抗生素的抗性基因等；等；C.具备多克隆位点（具备多克隆位点（Multiple Clone Sites，MCS），），而且可携带外源而且可携带外源DNA片段的长度范围较宽片段的长度范围较宽;D.自身分子量较小，在寄主细胞中的拷贝数高，易自身分子量较小，在寄主细胞中的拷贝数高，易于操作和于操作和DNA的制备E.具有较好的安全性，不能任意转移具有较好的安全性，不能任意转移载体的分类载体的分类根据载体工作方式的不同可分为根据载体工作方式的不同可分为质粒载体质粒载体（plasimid vectors）、噬菌体载体（）、噬菌体载体（phage vectors）、）、 噬菌体噬菌体-质粒杂合载体（考斯质质粒杂合载体（考斯质粒）粒） 质粒的概念：质粒是一种广泛存在于细菌细胞中独立质粒的概念：质粒是一种广泛存在于细菌细胞中独立于于染色体以外染色体以外的能的能自主的复制自主的复制的裸露的遗传物质。

的裸露的遗传物质大多数质粒是闭合大多数质粒是闭合环状双链环状双链DNA分分子，比病毒更简单子，比病毒更简单在霉菌、蓝藻、在霉菌、蓝藻、酵母和一些动植物酵母和一些动植物细胞中也发现了质细胞中也发现了质粒一一 质粒载体（质粒载体（plasimid vectors） 质粒的特点质粒的特点（1）自主复制性自主复制性质粒含有自己的复制起质粒含有自己的复制起始位点（始位点（Origin,简称简称ori），有些质粒具有），有些质粒具有独立的复制子结构（独立的复制子结构（Replicon），因此，），因此，质粒质粒DNA可以自主复制，形成少则几个多可以自主复制，形成少则几个多则成百上千个拷贝则成百上千个拷贝2）可扩增性可扩增性在格兰氏阴性细菌中，质在格兰氏阴性细菌中，质粒的复制一般有两种复制形式，即严紧型粒的复制一般有两种复制形式，即严紧型（Stringent）和松弛型（）和松弛型（Relaxed）质粒的复制类型：质粒的复制类型：一种质粒在宿主细胞中一种质粒在宿主细胞中存在的数目称为该质粒的存在的数目称为该质粒的拷贝数拷贝数根据拷贝数的多少将质粒分为两种复制型：贝数的多少将质粒分为两种复制型：“严严紧型紧型”质粒质粒（stringent plasmid）,拷贝数为拷贝数为1-5；“松弛型松弛型”质粒（质粒（relaxed plasmid）,拷贝数为拷贝数为6-606-60。

不过，即使是同一质粒，不过，即使是同一质粒，其拷贝数在不同的寄主细胞间也可能有很其拷贝数在不同的寄主细胞间也可能有很大的变化大的变化严紧型质粒（严紧型质粒（Stringent）：这类质粒的复制）：这类质粒的复制由细胞内由细胞内DNA聚合酶聚合酶介导，并被质粒上编介导，并被质粒上编码的蛋白因子正调控，由于这些蛋白因子极码的蛋白因子正调控，由于这些蛋白因子极不稳定使得每个细胞只能复制少数几个质粒不稳定使得每个细胞只能复制少数几个质粒拷贝，一般把一个细胞内拷贝数少于拷贝，一般把一个细胞内拷贝数少于5个的个的质粒称为严紧型质粒质粒称为严紧型质粒松弛型质粒（松弛型质粒（Relaxed）：这类质粒的复制需）：这类质粒的复制需要半衰期较长的要半衰期较长的DNA聚合酶聚合酶、RNA聚合酶聚合酶及其他复制辅助蛋白因子，这类质粒在宿主及其他复制辅助蛋白因子，这类质粒在宿主细胞中一般可达到细胞中一般可达到3050个拷贝，所以称为个拷贝，所以称为松弛型质粒松弛型质粒质粒的氯霉素扩增：当宿主细胞进入生质粒的氯霉素扩增：当宿主细胞进入生长后期，加入长后期，加入氯霉素可以抑制宿主细胞氯霉素可以抑制宿主细胞蛋白质的生物合成，阻断宿主菌的大部蛋白质的生物合成，阻断宿主菌的大部分代谢途径，分代谢途径，松弛型质粒就能利用丰富松弛型质粒就能利用丰富的原料及能量进行复制，最终每个细胞的原料及能量进行复制，最终每个细胞就能累积上千个就能累积上千个DNA分子，把这种操作分子，把这种操作称为质粒的氯霉素扩增。

称为质粒的氯霉素扩增3）可转移性可转移性在移动基因在移动基因mob、转移基因转移基因tra、顺式作用元件顺式作用元件bom等因子的作用下，许多等因子的作用下，许多野生型质粒可以通过细胞的接合野生型质粒可以通过细胞的接合（conjugation）作用从一个宿主细胞转移）作用从一个宿主细胞转移到另一个宿主细胞中到另一个宿主细胞中4）不相容性具有相同或相似复制子结）不相容性具有相同或相似复制子结构及特征的两种不同的质粒不能稳定的构及特征的两种不同的质粒不能稳定的存在于同一个受体细胞的现象称为质粒存在于同一个受体细胞的现象称为质粒的不相容性（的不相容性（incompatibility）细胞分裂细胞分裂理想质粒的改造与构建理想质粒的改造与构建（1）删除不必要的）删除不必要的DNA区域尽量缩小质粒区域尽量缩小质粒的相对分子量，以提高外源的相对分子量，以提高外源DNA的装载量；的装载量； 一般大于一般大于20Kb的质粒转化率很低而且不稳定的质粒转化率很低而且不稳定2）灭活某些质粒的编码基因如灭活编码）灭活某些质粒的编码基因如灭活编码质粒转移的质粒转移的mob基因以提高质粒的安全性，基因以提高质粒的安全性，灭活对质粒的复制产生负调控的基因，以提灭活对质粒的复制产生负调控的基因，以提高质粒的拷贝数。

高质粒的拷贝数3）加入易于识别的选择标记基因加入易于识别的选择标记基因选择标记基因：选择标记基因：在基因工程中的一类用于在基因工程中的一类用于选择转化细胞（菌）的抗性基因，通过选择转化细胞（菌）的抗性基因，通过在培养基中加入特定的抗生素就可以筛在培养基中加入特定的抗生素就可以筛选得到转化的细胞（菌）选得到转化的细胞（菌） 常用的抗生素抗性基因有：常用的抗生素抗性基因有：Ampr(氨苄氨苄青霉素抗性基因青霉素抗性基因)、Kanr (卡那霉素抗性卡那霉素抗性基因基因)、Tetr (四环素抗性基因四环素抗性基因)、Cmr 或或cat(氯霉素抗性基因氯霉素抗性基因)、Neor (新霉素抗性新霉素抗性基因基因)；LacZM15缺失第缺失第11-41位的氨基酸位的氨基酸LacZ N端端140个氨个氨基酸基酸LacZMCS140个氨基酸个氨基酸+MCSLacZ1024个氨基酸个氨基酸LacZM15F质粒质粒载体载体LacZE.coliLacZ M15+ LacZX-galLacZ M15+ LacZDNAX-gal筛选标记基因：筛选标记基因：-互补互补 大大肠肠杆杆菌菌 -半半乳乳糖糖苷苷酶酶 可可以以和和其其底底物物X-Gal 相相互互作作用用并并且且释释放放出出一一种种蓝蓝色色物物质质，当当该该酶酶的的 -片片段段和和 -片片段段分分开开时时就就失失去去了了这这种种显显色色的的功功能能。

通通常常将将缺缺失失了了第第11-41位位氨氨基基酸酸的的编编码码 片片段段的的LacZM15构构建建在在F质质粒粒上上先先转转入入大大肠肠杆杆菌菌中中，而而将将编编码码该该酶酶N端端140个个氨氨基基酸酸的的 -片片段段的的LacZ基基因因插插入入到到载载体体的的多多克克隆隆位位点点的的侧侧翼翼序序列列中中当当含含有有LacZ基基因因的的载载体体导导入入到到这这类类寄寄主主细细胞胞中中时时，载载体体编编码码的的 -片片段段就就能能和和寄寄主主编编码码的的 片片段段发发生生互互补补并并具具有有了了对对底底物物X-gal的的作作用用功功能能（发发生生显显色色反反 应应 ） ， 这这 种种 现现 象象 被被 称称 为为 是是 -互互 补补 （ alpha-complementation）.将这种筛选方式称为蓝白斑筛选）将这种筛选方式称为蓝白斑筛选）蓝白斑筛选（4）在筛选标记基因内引入具有多种限制性内）在筛选标记基因内引入具有多种限制性内切酶识别及切割位点，即多克隆位点切酶识别及切割位点，即多克隆位点（Multiple Clone Site,即即MCS）,便于外源基因便于外源基因的重组；的重组；多克隆位点多克隆位点(MCS)：克隆载体中的一段用于插入克隆载体中的一段用于插入外源外源DNA片段的特定区域，由一系列的紧密相片段的特定区域，由一系列的紧密相连的限制性内切酶位点组成，而且每个限制性连的限制性内切酶位点组成，而且每个限制性内切酶位点应该在整个载体中是唯一的。

内切酶位点应该在整个载体中是唯一的5）根据外源基因克隆和表达的不同要求，）根据外源基因克隆和表达的不同要求，加装特殊的基因表达调控元件加装特殊的基因表达调控元件质粒的分类：质粒的分类：根据其功能和用途将根据其功能和用途将人工构建的质粒分为以下几类：人工构建的质粒分为以下几类：克隆质粒、测序质粒、整合质粒、克隆质粒、测序质粒、整合质粒、穿梭质粒、探针质粒、表达质粒穿梭质粒、探针质粒、表达质粒等质粒的种类及用途质粒的种类及用途（1 1）克隆质粒克隆质粒用于用于克隆和扩增外源基因克隆和扩增外源基因2）测序质粒测序质粒有有MCS，并在，并在MCS两端设有两端设有两个不同的引物，两个不同的引物，便于便于DNA测序如如pUC18/193）整合质粒整合质粒含有整合酶编码基因及整合特含有整合酶编码基因及整合特异性的位点序列，克隆在这类质粒上的基因在异性的位点序列，克隆在这类质粒上的基因在进入宿主细胞后能准确的重组整合在受体细胞进入宿主细胞后能准确的重组整合在受体细胞染色体基因组的特定位点上染色体基因组的特定位点上4）穿梭质粒穿梭质粒这类质粒含有两种不同的复制这类质粒含有两种不同的复制子结构及相应的选择标记性基因，因此能在两子结构及相应的选择标记性基因，因此能在两种不同的种属细胞中复制并检测。

如大肠杆菌种不同的种属细胞中复制并检测如大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒，大肠杆菌链霉菌穿梭质粒，大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒酵母菌穿梭质粒5）探针质粒探针质粒这类载体用来构建或筛选克隆这类载体用来构建或筛选克隆基因的表达调控元件，如启动子和终止子基因的表达调控元件，如启动子和终止子6）表达质粒表达质粒这类质粒在这类质粒在MCS的上游的上游和下游分别装有两套转录效率较高的启和下游分别装有两套转录效率较高的启动子、合适的核糖体结合位点（动子、合适的核糖体结合位点（SD-序列）序列）以及强有力的终止子结构使得克隆在合以及强有力的终止子结构使得克隆在合适位点上的任何外源基因均能在受体细适位点上的任何外源基因均能在受体细胞中高效表达，如胞中高效表达，如pET系列质粒系列质粒质粒DNA的提取与纯化大肠杆菌基因组大肠杆菌基因组DNA 一、质粒DNA的提取plasmid DNAThe genomic DNA of E. coli: a single circular double-stranded DNA, with the contour length about 850 times longer than the cell.Genomic DNA 闭合环状的质粒闭合环状的质粒DNA，在变性后不会，在变性后不会分离，复性快；分离，复性快；（1）原理1. 碱裂解法提取质粒碱裂解法提取质粒DNADNA双链双链变性变性DNA单链单链复性复性强碱强。