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ACE基因的多态性一、实验目的一、实验目的•掌握从微量来源的组织细胞中掌握从微量来源的组织细胞中抽提抽提基因组基因组DNADNA•掌握掌握PCRPCR技术原理技术原理•了解了解基因多态性分析基因多态性分析的方法ACE基因多态性分析基因多态性分析(血管紧张素转换酶血管紧张素转换酶, Angiotesin converting enzyme, ACE)基因诊断基因诊断：利用现代分子生物学和分子遗传学的方法，：利用现代分子生物学和分子遗传学的方法，从从DNADNA、、RNARNA水平检测基因的存在、结构异常和表达状水平检测基因的存在、结构异常和表达状态，从而对疾病做出诊断的方法态，从而对疾病做出诊断的方法基因多态性基因多态性：指在一随机婚配的群体中，染色体同一：指在一随机婚配的群体中，染色体同一基因座位点上有两种或两种以上的基因型，它可决定基因座位点上有两种或两种以上的基因型，它可决定人体对疾病的人体对疾病的易感性易感性、临床表现多样性和对药物治疗、临床表现多样性和对药物治疗反应的差异性反应的差异性•理论基础理论基础 ACEACE基基因因第第1616内内含含子子存存在在一一段段长长度度为为287bp287bp（（Alu序序列列））的的插插入入/ /缺缺失失（（I/DI/D））多多态态性性片片段段，，I/DI/D多多态态性性与与血血液液ACEACE水水平平有有明明确确关关系系，，DDDD型型ACEACE水水平平最最高高，，IDID次次之之，，IIII最最低低。

左左室室肥肥大大患患者者中中DDDD型频率明显增高型频率明显增高•实验原理实验原理 以以DNADNA为为模模板板，，ACEACE基基因因特特异异的的引引物物序序列列位位于于287bp287bp插插入入/ /缺缺失失片片段段的的两两侧侧进进行行PCRPCR扩扩增增，，故故IIII型型扩扩增增片片段段长长度度约约为为490bp490bp，，DDDD型型扩扩增增片片段段长长度度约约为为190bp190bp，，IDID型型扩扩增增片片段段为为２２个个，，分分别别为为190bp190bp和和490bp490bp根据PCRPCR扩增片段的大小可进行多态性分析扩增片段的大小可进行多态性分析 插入片段插入片段插入型插入型缺失型缺失型490bp190bp操作步骤操作步骤•基因组基因组DNADNA抽提抽提•PCRPCR反应反应•琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电泳检测1. 1. 基因组基因组DNADNA抽提抽提•溶液溶液ⅠⅠ 10 ml 10 ml 漱口漱口2020秒秒 收集漱口水；收集漱口水； 3000g×5min×RT3000g×5min×RT，弃上清；，弃上清；•溶液溶液Ⅱ 250 ul Ⅱ 250 ul 重悬沉淀；重悬沉淀； 3000g×1min3000g×1min，弃上清；　，弃上清；　•溶液溶液Ⅲ 250 ul Ⅲ 250 ul 重悬沉淀，振荡重悬沉淀，振荡1010秒；（秒；（变性变性）） 转至转至0.5 ml0.5 ml离心管，离心管， 99℃×5min99℃×5min；；•加溶液加溶液IV 50 ul IV 50 ul 振荡振荡5 5秒；（秒；（中和中和）） 3000g×1min3000g×1min，，•上清转移至新上清转移至新0.5 ml0.5 ml离心管，取离心管，取5 ul5 ul用于用于PCR.PCR.2. PCR2. PCR反应反应•取消毒的取消毒的0.5 ml0.5 ml离心管，加入下列成分：离心管，加入下列成分： 10×PCR Buffer10×PCR Buffer dNTP(2.5 mM each) dNTP(2.5 mM each) mix: 10μl10μl Taq DNA polymerase Taq DNA polymerase DNADNA模板模板 5 μl5 μl 引物混合物引物混合物(10μM each) 2 μl(10μM each) 2 μl ddH ddH2 2O 3 μlO 3 μl　　 总体系总体系 20 μl20 μl•扩增程序为：扩增程序为：94℃94℃变性变性30s30s，，55℃55℃复性复性30s30s，，72℃72℃延伸延伸40s40s，共反应，共反应3535个个循环。

循环琼脂糖电泳检测琼脂糖电泳检测•制备制备1 1％琼脂糖凝％琼脂糖凝•点样，电泳点样，电泳•紫外灯下观察结果紫外灯下观察结果ACEACE基因多态性电泳图基因多态性电泳图2k1k750bp500bp250bp100bp 结束语结束语谢谢大家聆听！！！谢谢大家聆听！！！14。