核磁共振波谱法在多糖结构分析中的应用1.docx

核磁共振波谱法在多糖结构分析中的应用摘要: 多糖功能复杂，有控制细胞分裂和分化，调节细胞的生长和衰老，作为无细胞毒性的 免疫促进剂，已发展成为一种免疫方法,但是多糖由于结构复杂使解析结构非常繁琐和困难， 使对各种多糖的深入研究受限核磁共振波谱法(NMR)是解析物质结构最有效的手段，近年 该技术的发展也很迅速本文综述了一维核磁共振和二维核磁共振波谱法在多糖结构分析中 的应用这些技术可以提供如多糖的单糖组成、单糖残基间的顺序、单糖残基在糖苷键中的 位置、环状结构的类型和糖苷键的构型等许多信息，成为分析多糖结构不可缺少的工具关键词: 多糖 核磁共振 一维核磁共振 二维核磁共振多糖功能复杂，有控制细胞分裂和分化，调节细胞的生长和衰老，作为无细胞毒性的免 疫促进剂，已发展成为一种免疫方法［1］另外，在肿瘤、,血管、肝炎、糖尿病、甚至艾滋 病等疾病方面显示出特殊的效果，有些已在临床上广泛应用［2］多糖功能是由其结构决定的结构是多糖活性的基础，多糖一级结构的研究包括单糖残 基的种类和顺序，多糖残基在糖苷键中的位置，环状结构的类型和糖苷键的构型而组成多 糖的单糖品种繁多，单糖的连接顺序、连接位置的不同以及是否存在侧链使多糖结构更具复 杂性，其结构鉴定也更困难。

目前常用的多糖结构分析方法主要分为化学分析法、生物学分 析法和物理分析法3大类，其中物理分析法包括核磁共振波谱(NMR)、红外光谱、质谱、x 一射线衍射光谱等［3］现将近年来核磁共振波谱在多糖结构分析中的应用进展作一综述1 ID NMR谱在多糖结构研究中的应用1. 1 iH NMR 谱对于多糖分子来说，由于不同糖残基中非异头质子的亚甲基和次甲基的化学位移非常靠 近，结果它的H NMR谱峰严重重叠，大部分质子共振峰出现在& 3. 0〜4. 0的非常小的区 域内，给解析带来困难不在共振拥挤区的HNMR信号被称为“结构信息共振信号”，是分 析谱图的突破口这种共振信号包括6位脱氧糖的甲基(H—6)和异头质子(H-1),尤其是异头 质子的信号对多糖结构的解析具有重要意义：一方面，其信号的线宽和积分可用于区别糖单 元的类型及其相对含量；另一方面，也是最重要的一方面，可根据其化学位移和偶合常数的 数值大小，来确定多糖结构中糖苷键的构型通常6 一糖苷的异头氢的共振比一糖苷向低 场位移0. 3〜O. 5，前者一般出现在34. 8〜5. 3处，而后者一般出现在4. 4〜4. 8处同时，按Karplus关系，在n—构型中二面角为6oo左右，只能观察到H. 1和H. 2之间小 的偶合(J=2-4Hz)，而在B —构型中，H— 1和H一2的反式竖键关系形成180的二面角，产生 大的偶台(J =7-9Hz)。

当然，这只是一般性的规律,不能一概而论［4］如从真菌Termitomyces eurhizus的子实体中得到的葡聚糖PS-I, 1H. NMR中异头质子与邻位质子的J为3 Hz，表明其葡萄糖残基均为a构型［5］解析图谱时一般先找出容易辨认的质子信号，如异头质子， 再通过相同偶合常数的信号来确定其邻位质子1 . 2 13CNMR微型计算机的脉冲傅利叶转换方法(F. r)在13CNMR上的应用，使得天然丰度很低的13C 多糖能得到清晰的光谱其化学位移范围远较1HNIR宽，达到200 ppm目前，CNMFI在多糖 结构分析上应用有：(1)异头碳的构型问题葡吡喃二糖异头碳的共振讯号位置， a 型连接的 为97〜101ppm, B型连接为103〜105 ppm (2)多糖残基中取代位置和分枝点的确定在(1-6) 一a 一D-葡吡喃糖残基连接的多糖组成中，若在2、3或4位羟基上未被取代，则C—l异头碳 共振在90〜95 ppm， C-2、C-3、c4或C-5共振在70〜75 ppm， C-6在60〜70 ppm共振，一般 为62 ppm若发生0-取代，在c—l异头碳位移到97〜101 ppm，C-2、c一3、C4或C-5上的 位移到76〜85ppm. c-6共振移到68 ppm。

3）多糖中各残基种类和比例MNMR的谱图上，不同 糖残基的异头碳有不同化学位移，且峰相对高度正比于碳的数目，常借此确定糖基种类和计 算不同残基的相对比例［6］Jansso口等［7］设计的计算机程序CASPER,用于测定具有有序重复单元的多糖结构该程 序利用多糖的13C. NMR及单糖和甲基化分析的信息，基于重复单元中单糖的特性和不同连接 位置的差异，构建出所有可能的排序借助从二糖获得的3 C—NMR化学位移数据，模拟出可 供选择的结构波谱，从中筛选出与所测未知多糖波谱最一致的结构该程序验证了2个已知 多糖，均得到了正确的结构后来发展的CASPER扩展版本，利用田一NMR及2D—NMR的信息， 可以测定具有分枝的复杂多糖的结构验证了4个已知多糖，有3个多糖的结构被正确推导出， 第4个多糖测定出与NMR相一致的有2个，其中有一个是正确的结构该程序在后来的多糖结 构分析中也得到了应用［8］2二维核磁共振（2D-NMR）1971年Jeener首先提出二维NMR谱方法；1976年Erns t确立了 2DNMR的理论基础并通过实 验加以证明，其后Erns t和Freema n等又为2DNMR的发展和应用进行了深入的研究，迅速发展 了多种二维方法并把它们应用到物理化学和生物学的研究中［9］.通常，测定糖类样品一维 1HNMR和13CNMR谱可得到其整体结构信息，二维NMR谱，如同核化学位移相关谱、H检测的异 核多量子相干相关谱、H检测的异核多键相干相关谱能给出相关碳氢连接方式方面的信息 ［10,11］ 。

2. 1 同核位移相关谱2. 1. 1 COSY（化学位移相关谱，）COSY能够提供糖环中相邻氢核之问的耦合关系COSY谱中，每个交叉峰反映了相邻氢核 之间的耦合关系交叉峰的强度与其有关的 3J 值密切相关， 3J 值大，交叉峰的强度就大， 反之亦然由于异头质子易于确认，所以一般从异头质子的对角线峰出发，首先找到H1/H2 的交叉峰，通过划线即可找出H2的对角线峰再由H2的对角线峰出发，依次找出H3〜H6的对 角线峰和化学位移2. 1. 2 C0SY-45（0 —COSY）COSY的脉冲序列由两个90的脉冲组成如果减小第二个脉冲的宽度，使其倾倒角减小， 则会对交叉峰及对角线峰的精细结构产生影响在COSY-45中，第二个脉冲角度是45°与 COSY相比，COSY-45减少了平行跃迁问的磁化转移强度，限制了多重峰的问接跃迁，对角线 峰则因自身的自相关峰消失而简化因此，COSY-45谱中的对角线峰沿对角线变窄，减少了 对邻近的交叉峰的干扰，有利于复杂分子的密集峰群的解析另外，从COSY-45还可判别耦 合常数的符号对于多糖，推荐采用COSY-45谱Kilcoyne等从Pseudoalteromonas rubra ATCC29570中得到一个复杂的多糖，采用二维COSY,使每个质子的信号得到了确认［12］。

2. 1. 3 DQF-COSY（双量子滤波COSY，）就自旋体系的识别而言，DQF—COSY所能提供的信息与COSY毫无二致DQF-COSY的优点 在于它抑制了强峰和溶剂峰，而且由于对角线峰和交叉峰均为吸收型，所以分辨率较高然 而，DQF-COSY的灵敏度比同等条件下的COSY低2. 1. 4 TQF-COSY（三量子滤波COSY）TQF—COSY只能显示至少三个以上两两耦合的自旋之间的交叉峰对于糖环而言，满足 这一条件的质子一般只有H5和H6（6位通常有两个质子），而在COSY谱中出现的其它谱峰均被 “洗白”因此，TQF-COSY可以作为COSY谱的一个补充，用于识别ITS和H6在很多情况下， 单靠COSY并不能完成多糖中各个糖环质子的识别这种不完全的识别往往是由于缺乏质子间 的交叉峰连接l4J交叉峰的缺失可能是由于以下原因造成的：1）也是最常见的原因，是两 个化学位移很接近而相互间的耦合又较强的两个质子的交叉峰很容易掩埋在对角线峰中；2） 两个质子间的耦合太弱，因而所形成的交叉峰强度太小，难于观测； 3）由于谱峰相互重叠， 有的交叉峰可能根本无法识别总之，还有必要做其它的一些实验作为补充才能完成谱峰的 识别。

2. 1. 5 TOCSY(全相关谱)COSY给出的是相邻氢核间的相关峰，而TOC—SY给出的是同一自旋体系中所有氢核间的 相关峰，包括长程耦合和短程耦合从任一谱峰出发，可以找到好几个相关峰，它们与该氢 核处于同一自旋体系，女0H1/H2, H1/H3, H1/H4等，因而可能克服一些3OSY谱中由于谱峰 重叠造成的困难TOCSY可以作为COSY谱的补充和验证如从Rhodococcus sp. 33t中［13］得到的一个杂多糖，其单糯组成从TOCSY图谱特征中 得到证实，并由其确定了各质子的化学位移值，其中单糖残基A为半乳糖，H. 1 (6 4. 48) 显示与H一2 (6 3. 64)，H一3(6 3. 78), H. 4 (6 4. 1 6)的相关；单糖残基B为葡萄糖，H. 1(6 4. 63)显示与H一2 (6 3. 4 1)、H. 3 (6 3. 67)、H一4 (6 3. 63)、H—6a(6 3. 78)、H 36b(63. 78)的相关；单糖残基C为甘露糖，H一 1(6 4. 66)只显示与H. 2 (6 4. 18)的偶合相关； 单糖残基D为葡萄糖醛酸，H一1(6 4. 69)显示与H. 2 (6 3. 46)、H. 3 (6 3. 65)、H一4 (63. 75)的相关。

Proteus mirabilis的脂多糖经缓和酸水解后，分离到一个O—多糖，建立在 偶合常数的基础上，从其COSY和TOCSY谱中鉴定了一个半乳糖和两个乙酰氨基葡萄糖的自旋 系统，并从偶合常数J从而判断出单糖的构型［14］2. 1. 6 NOESYNOESY的外观与COSY相似，其差别在于交叉峰表示的不是耦合关系，而是NOE关系通常 间距小于5A的两个质子，在谱上会出现交叉峰，且空间距离越近，NOE作用越强对于多糖， NOESY可作为COSY的补充来识别谱峰，也可用来确定糖残基间的连接方式Larocque等从Bordetella arium中得到的0—多糖，单糖残基内(H2, H 4)和(H 3， H5 ) 强的NOE效应证实了葡萄糖残基的存在，(H1,H3)和(H1,H5)强的NOE效应表明它是B —构型， 而(H1, H 4)NOE相关峰的出现为1, 4一糖苷键的特征Mondal等从食用蘑菇Termitomyces eurhizus的子实体中得到两个多糖PS. I和PS —II,通过NOESY实验确定了单糖残基间的连接 顺序［15］ 2. 2 碳氢相关谱2. 2. 1 HSQC(异核单量子相干)HSQC反映的是直接相连的1 H、曲核之间的耦合关系，它的作用相应于H, C—COSY。

在 用H, H COSY等将糖单元的氢核的化学位移进行归属后，通过HSQC，就可将碳核的化学位移 进行归属此外，如果某些氢核的谱峰由于重叠无法识别，可以根据已识别的5 H由HSQC推 出相应的5 C,然后再根据13C NMR谱的峰形和峰高，结合甲基化分析的结果，对未知的5 H 进行反推通过HMQC或HSQC,可以找出与异头碳质子相连的碳的信号及糖基上每个质子所连接的碳 的信号由Providencia alcalifaciens脂多糖温和酸降解得到的0—多糖，其HSQC图谱揭示 了直接相连C, H之间的相关，698. 2处的C信号分别与6 5. 08, 6 4. 79的H信号有偶合关系， 提示6 98. 2为两个异头碳的重叠峰，结合甲基化分析和其它二维谱，使得每个C、H的信号 得到归属2. 2. 2 HMB。