炭疽病原精要课件.ppt

炭疽的病原学与实验室检测,自治区疾控中心应急办 赛娜瓦尔,内容,病原学 培养特性与生化反应 抗原结构 致病性 毒力 变异性 抵抗力 军事医学意义 实验室检测 鉴定方法,病原学,形态与染色炭疽芽孢杆菌是病原菌中最大的杆菌之一，大小为（3～5）um×（1～1.2）um，革兰氏染色阳性，无鞭毛，无动力，有荚膜，能形成芽孢镜检两端平切，在动物和人体标本中，常呈单个或短链排列，在人工培养基中常形成竹节状长链，有的链长达数百个菌体，菌体相连处有胞间链丝形态与染色炭疽杆菌在机体内或含血清或碳酸氢钠特殊培养基中可形成荚膜荚膜抗腐败能力大于菌体，因此在腐尸检片中可见到称为菌影的无内容物的荚膜荚膜是由质粒DNA编码，无毒菌株不产生荚膜荚膜成分为D-多聚谷氨酸，由荚膜质粒控制，与炭疽杆菌治病力有关，在体内能抑制白细胞的吞噬和消化，在体外能阻断菌体胞壁上的噬菌体受体，有助于病菌在体内繁殖扩散和建立感染病原学,芽孢炭疽杆菌是需氧芽孢杆菌属（Bacillus）中最重要的致病菌，在有氧、温度适宜（25-30℃）的外界环境或人工培养基上，易形成芽孢。

芽孢位于菌体中央，呈椭圆形，孢子囊不膨大芽孢又称内生孢子，带有完整的核质、酶系统，合成菌体的机构，保存细菌的全部生命活性病原学,图1 在血琼脂平板上炭疽杆菌 G（X1000）,图2 带芽胞炭疽杆菌，G（1000）,芽孢在适宜的条件下，芽孢通过激活、发芽、生长3个阶段又可成为新的繁殖体，继续分裂、增殖、活跃生长，所以芽孢是处于休眠状态的细菌，广泛存在于空气、尘埃、地表、水源、土壤和腐烂物体中每种细菌的芽孢形态、大小和在菌体中所处部位相当稳定，这在细菌鉴别上重要意义病原学,芽孢芽孢具有多层厚膜结构，其中芽孢壳由一种类似角蛋白的疏水蛋白组成，非常致密、不具渗透性，对外界抵抗力强，能抵抗表面火性剂、化学药物的渗透和常用物理灭菌法 病原学,芽孢炭疽芽孢污染点难以彻底消除，往往成为顽固疫点，是炭疽的自然疫源地，也是炭疽在畜间、人间暴发流行的源头芽孢是炭疽杆菌在自然条件下存在的主要形式；在宿主体内和完整尸体内，炭疽杆菌保持繁殖体形态，不形成芽孢所以，炭疽病死尸体严禁解剖、屠宰、剥皮，以防止炭疽芽孢污染环境病原学,芽孢由于炭疽芽孢可大量制备、长期存放，并适宜于气溶胶施放，其在军事医学上有特殊意义。

人吸入极微量的炭疽芽孢即可造成致死性感染美国国会报告中称，于大都市在适宜的气象条件下施放1Kg的炭疽芽孢，可造成数十万人员死亡，其威力可见一斑病原学,培养特性与生化反应,炭疽杆菌营养要求不高，一般营养肉汤和普通琼脂均可生长，需氧菌或蒹性厌氧菌，最适pH7.2-7.4，最适温度34-37℃，低于12℃或高于45℃则不能生长菌落灰白色粗糙型，表面稍隆起，干燥无光泽不透明，边缘不整齐，常有小尾突起，放大镜观察菌落呈卷发状，边缘有菌丝射出的典型菌落形态培养特性与生化反应,培养3天后，菌落表面有小泡状颗粒即所谓仔集落在血琼脂平板上，早期无溶血环，培养24h后有轻微溶血有毒株在含动物血清培养基或0.9%NaHCO3培养基，置于20%CO2、37℃条件下培养24-48h可形成粘液性菌落，用接种针挑取时可见拉丝状，此粘液物质为炭疽菌的荚膜，主要成分为D-多聚谷氨酸：无毒株不形成荚膜，菌落仍保持粗糙型培养特性与生化反应,炭疽杆菌在适当浓度青霉素溶液作用下，菌体形态发生肿胀，成为均匀链状串珠，称为串珠试验，对本菌有鉴别意义，其他需氧芽孢杆菌无此现象培养特性与生化反应,在肉汤培养时由于形成长链，呈絮状发育，管底有絮状、卷绕成团的沉淀，液体透明，摇之均匀浑浊，不形成菌膜或壁环。

炭疽杆菌能分解葡萄糖、麦芽糖、果糖，产酸不产气，不分解乳糖、阿伯拉糖、甘露醇、水杨素，不产生H2S在明胶培养基中经37℃24h培养，可使表面液化呈漏斗状，由于细菌沿穿刺线向四周扩散成倒松树状生长在某些培养基上，炭疽杆菌在培养6h开始产生紫红色色素，在碱性条件下为红色，24h达高峰，色素的生物学功能不详，据认为与培养基的硫酸亚铁含量有关培养特性与生化反应,抗原结构,炭疽芽孢杆菌的抗原组成主要包括荚膜抗原、菌体抗原、芽孢抗原及保护性抗原等四种成分抗原结构,荚膜多肽抗原：仅见于有毒菌株，是由D-谷氨酸多肽组成的一种半抗原，可由腐败破坏而失去抗原性，具抗吞噬作用与细菌毒力有关由质粒DNA（pOX2）编码，质粒丢失，形成荚膜能力也消失荚膜抗原所产生的抗体对动物无保护作用若以高效价抗荚膜多肽血清作荚膜肿胀试验及免疫荧光抗体试验，对鉴定本菌有一定意义抗原结构,菌体多糖抗原：由N-乙酰葡萄胺、D-半乳糖组成，与毒力无关由于耐热、耐腐败，在病畜皮毛和腐败脏器中的此抗原虽经长时间煮沸仍可与相应抗体（特异免疫血清）发生沉淀反应，称Ascoli热沉淀反应，对追溯炭疽芽孢杆菌病源方面有用但由于此抗原特异性不高，与其他需氧芽孢杆菌、14型肺炎链球菌，甚至人类A血型抗原之间发生交叉反应，故Ascoli反应目前已很少使用。

抗原结构,芽孢抗原：由芽孢的外膜、芽孢壳等组成的芽孢特异性抗原，具有免疫原性和血清学诊断价值最新研究发现炭疽芽孢抗原在炭疽芽孢感染、致病和免疫上也起作用芽孢外膜的胶原样糖蛋白是免疫显性抗原，能刺激机体产生强烈免疫应答抗原结构,保护性抗原（PA）：是一种胞外蛋白质抗原成分，在人工培养条件下亦可产生，为炭疽毒素的组成成分之一，具有免疫原性，能使机体产生抗炭疽杆菌的保护力庄汗澜、牟兆钦等探讨了保护性抗原（PA）的免疫机制，发现：1、PA免疫后，动物产生抗PA抗体、血中吞噬细胞被激活，抗PA抗体除中和作用外，在体内能直接杀灭炭疽芽孢杆菌；2、PA免疫动物抑制入侵的炭疽芽孢出芽，在炭疽强毒芽孢攻击后1-3天内，PA免疫兔的肝、脾、淋巴结切片中只见少量芽孢而无繁殖体，而对照兔组织内细菌以繁殖体为主；,抗原结构,3、PA能非特异性的激活小鼠腹腔吞噬细胞，增强对入侵炭疽芽孢和金葡菌的吞噬和杀灭；4、被动转移PA免疫小鼠的血清和T细胞均可提高受体小鼠对炭疽芽孢的攻击保护，细胞免疫反应较弱，起着辅助B细胞的作用；,抗原结构,5、抗PA抗体水平与保护力之间并不绝对呈平行关系、如粗制PA免疫，抗体滴度不很高攻击后动物存活，而用纯化PA免疫，抗体滴度很高攻击后却有动物死亡，提示除抗PA抗体外，吞噬细胞及其他防御因素也参与抗炭疽保护力的形成。

抗原结构,致病性,炭疽杆菌对绵羊、山羊致病力最强，牛、马、驴、骡、驼、鹿等草食动物皆很易感，猪、犬、猫等杂食动物亦可感染；虎、狮、豹、狼等肉食动物，误食炭疽病畜肉，亦可引起感染而死亡猪常无症状，仅在宰后肉检时才被发现或仅局部出现淋巴结炎、咽峡炎，个别出现肺炎及败血症前苏联一家动物园因喂食病马肉，使一些豺、獾、貂、黄鼬、美洲豹、山猫、豹死亡，白熊感染发病家畜改良品种较土种易感，幼龄家畜较老龄家畜易感人对炭疽杆菌中等敏感、介于草食和肉食动物之间实验动物猴、兔、羊、豚鼠、大鼠、小鼠对炭疽人工感染皆相对敏感，其中猴、兔、羊、较豚鼠、大鼠、小鼠敏感在感染濒死阶段（临死前10-14h），血中菌数倍增时间：小鼠、豚鼠为50min，羊95min，大鼠115min致病性,炭疽毒株芽孢皮下感染兔后，芽孢出芽、增殖，全身扩散，血、肝、脾、肺、淋巴结等组织都可找到炭疽杆菌和芽孢，当菌数达108/ml时，实验兔死亡肺中菌数约比其他脏器高10倍；组织切片可见吞噬细胞内有芽孢和大量短链菌体位于细胞间隙按照猴数据推算，人LD50计量为吸入2500-55000个炭疽芽孢F-344大鼠是炭疽毒素试验的模型动物致病性,在自然界，野鼠中鼬鼠特别敏感，曾从自然条件中的大沙土鼠、黄胸鼠体内分离出炭疽杆菌。

鸟类在自然条件下是不感染的，只有马达加斯加和南部非洲的鸵鸟较常患病曾有报告，青蛙和鱼也能感染炭疽，国内也曾有从鱼体内分离出炭疽杆菌的报道致病性,毒力,炭疽的毒力依赖于荚膜和毒素两种成分，这两种成分是由不同质粒编码的荚膜物质在体内可防御吞噬消化，在体外可掩盖噬菌体受体，免于被噬菌体裂解毒素含有三个因子，即水肿因子（EF）、致死因子（LF）和保护性抗原（PA）其中水肿因子（EF）能使血管渗透压增加，大量浆液渗出，红细胞大量溶解引起血红蛋白和氧结合不全，可产生缺氧性休克；,致死因子（LF）是非常强大的毒素，只要一分子进入细胞，就可以导致细胞死亡致死因子作用于中枢神经，可以引起中枢麻痹，导致呼吸衰竭而死亡这两种毒素的作用都需要保护性抗原的协同才能发挥作用毒素作用是死亡的主要原因，但毒素产生的本身并不能使炭疽菌具有完全毒力，该菌需要在一个地方繁殖并从那里扩散，从而在体内产生致死量的毒素，这就需要荚膜的抗吞噬作用所以完全毒力的炭疽杆菌至少有两个特点：有荚膜、能产毒毒力,变异性,在自然条件下，炭疽杆菌易受物理、化学、生理因素影响而发生变异实验时会出现形状不一的光滑型或黏液型菌落、无明显卷发状边菌落、显示色素的菌落、不产生荚膜的菌株、毒力减弱或消失的菌株。

变异性,巴斯德（Pasteur1881年）通过42.5℃高温连续培育研制出兽用菌苗即炭疽杆菌减毒疫苗Vodkin和Leppla(1983年)首先发现了炭疽杆菌毒素质粒，Green等（1985年）又发现了炭疽杆菌荚膜质粒，后分别命名为Pxo1和Pxo2变异性,两个质粒的相继发现，证明了炭疽杆菌的自然毒力处决定于染色体基因外，还与两个编码质粒有关，从而对培养传代减毒、通过机体减毒、强烈理化因素作用等人工获得减毒菌株的方法中的分子机制和有关炭疽毒素产生的遗传学提供了合理的解释梁旭东等（1994年）对我国不同时期、不同地区、不同来源所收集的炭疽杆菌进行了质粒电泳图分析谱分析，强毒株含有两个质粒，弱毒株因表现型不同，所含质粒各异，但只能单一存在我国杨叔雅等通过新生霉素、紫外线等理化因子诱变、筛选，或无荚膜减毒株现已清楚，这些都是由于编码荚膜和毒素的质粒丢失而引起的变异变异性,变异性,Boehm用DNA-DNA杂交技术检测多株炭疽杆菌和蜡状杆菌发现，10株炭疽杆菌强、弱毒株的DNA同源性为90%-99%，与17株蜡状杆菌的DNA同源性为32%-59%根据《伯杰氏鉴定细菌学手册》，种内同源性为﹥70%，亚种间同源性为60%-70%。

炭疽杆菌与其他需氧芽孢杆菌的同源性未高于59%，因此炭疽杆菌应视为独立种变异性,大家公认全球的炭疽杆菌菌株间无多大差异，最近Smith等用重复序列可变数法分析从非洲Kruger国家公园分离的98株炭疽菌存在A、B2个基本型全球引起炭疽暴发流行的菌株皆属A型仅非洲存在A、B2个型菌株分离出B型菌株土壤的钙含量和pH值高于A型，提示基因型与泥土的化学特性相关抵抗力,炭疽杆菌繁殖体在56℃2h、60℃15min、75 ℃1min即可灭之常用的消毒方法也能迅速杀灭繁殖体在干燥的血液中能生存1个月以上，对低温抵抗力较强，保存于-15 ℃鲜肉中能存活两周以上抵抗力,芽孢对外界因素的抵抗力很强，气溶胶的衰亡率0.1%/min炭疽芽孢在学块和动物粪粒中可存活40年以上，在干燥明胶或琼脂中保存55年仍能发芽和有毒力，染色标本中的芽孢仍可引起实验感染，在皮革中也能生存数年抵抗力,Peeler证明，在堆肥中，温度达72-76.5℃，4天内可杀死芽孢腌渍一个半月可杀死肉中菌体，但芽孢仍有存活经石灰水处理的皮革在125天后芽孢仍有存活所以在自然条件下，炭疽芽孢在引发炭疽感染和传播上起着主要作用据报告煮沸10min、140℃干热2h、湿热121℃需30min和2h，紫外线照射需4h才能将芽孢杀死。

抵抗力,化学消毒剂以强氧化剂效果为好，如过氧乙酸、氯亚明、环氧乙烷炭疽芽孢对碘敏感，1：2500碘液10min即可破坏芽孢，如有污秽物不宜使用新配制的20%石灰乳、20%漂白粉需浸泡48h，可杀死芽孢甲醛杀灭力强，在有大量有机物存在时，采用10%甲醛溶液较1%碘液好。