蜡样芽孢杆菌启动子片段克隆及转录活性分析.docx

    蜡样芽孢杆菌启动子片段克隆及转录活性分析    张婷婷　马磊Reference：为研究蜡样芽孢杆菌基因的转录调控特征，通过鸟枪法和蓝白斑筛选，获得57个蜡样芽孢杆菌启动子片段，并以β-半乳糖苷酶为报告基因，比较了这些启动子片段在大肠埃希菌中的转录活性对转录活性较高的4个启动子克隆片断进行测序、序列比对、特征分析，发现这4个克隆序列具有启动子元件、核糖体结合序列特征，其中2个克隆序列在枯草芽孢杆菌也表现出活性，表明兼有蜡样芽孢杆菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌RNA聚合酶σ因子序列识别特征Keys：启动子；随机克隆；蜡样芽孢杆菌；枯草芽孢杆菌Q933 ： A ：1002-1302（2014）04-0025-03收稿日期：2013-11-01基金项目：国家自然科学基金（编号：31272416）；石河子大学高层次人才科研启动专项（编号：RCZX201137）；石河子大学优秀青年项目（编号：2012ZRKXYQ13）作者简介：张婷婷（1984—），女，新疆石河子人，硕士，讲师，主要从事微生物生态研究E-mail：[email protected]通信作者：马磊，博士，副教授，主要从事生物信息学与分子遗传研究。

E-mail：[email protected]蜡样芽孢杆菌属兼性厌氧微生物，可产生毒素引发呕吐、腹泻等肠胃疾病，严重威胁食品业[1]和饲养业然而，蜡样芽孢杆菌也可分泌抗菌物质，抑制有害微生物生长，降解土壤中的营养成分，改良生态环境，其产生的细菌蛋白酶也可被用于麻脱胶、明胶液化、牛奶胨化、还原硝酸盐、水解淀粉等用途虽然蜡样芽孢杆菌典型菌株（ATCC14579）基因组已完成测序[2]，但目前对蜡样芽孢杆菌基因表达调控系统的研究较少，其内在丰富的遗传资源有待开发本研究利用蜡样芽孢杆菌（ATCC14579）基因组文库资源分离、筛选了多个蜡样芽孢杆菌启动子序列，分析了其在大肠埃希菌和枯草芽孢杆菌中的转录活性及序列特征，旨在为构建高效表达系统奠定基础，也为多宿主比较研究提供途径1材料与方法1.1材料菌株Bacillus cereus ATCC14579、B.subtilis DB104、Escherichia coli DH5α购自中国典型培养物保藏中心 （CCTCC）；质粒pE（来自pUC18，携带E.coli 质粒复制区起始，E.coli rep）、pGDV1（携带B.subtilis 质粒复制区起始，B.subtilis rep）、pDL（携带β-半乳糖苷酶基因，bgaB）为石河子大学生命科学学院实验室保存；质粒pEB（E.coli-B.subtilis穿梭载体）、pEB-bgaB 为本研究构建。

限制性核酸内切酶、碱性磷酸酶、T4 DNA连接酶购自Promage公司，Taq DNA聚合酶、LA Taq DNA聚合酶购自宝生物工程（大连）有限公司，质粒提取、DNA回收试剂盒购自杭州维特洁生化技术有限公司引物见表11.2方法1.2.1启动子探测载体的构建质粒pGDV1携带1段枯草杆菌质粒复制起始区（B.subtilis rep），通过PCR技术得到该序列（5′端设置BglⅡ位点，3′端设置SacⅠ位点）在质粒pE基础上，在BglⅡ、SacⅠ之间插入枯草杆菌质粒复制起始区（B.subtilis rep），构建大肠埃希菌-枯草杆菌穿梭载体pEB，酶切鉴定5），与枯草杆菌σA（σ43）识别序列-35区、-10区有较高同源性，因此其在枯草杆菌中可能由σA起始转录虽然C1、C2、C5可能具有同源性较高的-10区，但-35区不太典型3结论与讨论本研究构建了以β-半乳糖苷酶（bgaB）[5]为报告基因，在大肠埃希菌、枯草杆菌中均能稳定复制的启动子探测载体（图1）该载体所携带的bgaB基因不含启动子和核糖体结合序列，且在其起始密码子（ATG）上游具有多个酶切位点（NotⅠ、BamHⅠ、PstⅠ），有利于启动子序列的克隆操作。

以往研究中启动子克隆载体多以抗生素和绿色荧光蛋白（GFP）为报告基因，但是利用抗生素作为启动子筛选和检测指标，会因宿主菌产生的耐药性引起假阳性，检测数据高于真实值；利用绿色荧光蛋白对设备的要求比较高bgaB对宿主细胞生长影响较小，可特异性分解X-gal生成蓝色菌落，便于筛选本研究应用启动子随机克隆、蓝白斑筛选、β-半乳糖苷酶酶活检测，成功获得了4个在E.coli中具有较高转录、表达活性的蜡样芽孢杆菌启动子序列，而且其中2个还能在枯草杆菌中转录和表达，因此它们具有多宿主RNA聚合酶σ因子序列识别特征Reference：[1]Monika E S，Martina F，Siegfried S，et al. Bacilus cereus，the causative agent of an emetic type of food-borne illness[J]. Molecular Nutrition & Food Research，2004，48（7）：479-487.[2]Ivanova N，Sorokin A，Anderson I，et al. Genome sequence of Bacillus cereus and comparative analysis with Bacillus anthracis[J]. Nature，2003，423（6935）：87-91.[3]Yuan G，Wong S L. Regulation of groE expression in Bacillus subtilis：the involvement of the sigma A-like promoter and the roles of the inverted repeat sequence （CIRCE）[J]. Journal of Bacteriology，1995，177（19）：5427-5433.[4]Cutting S，Vander H. Genetic analysis，in C. R. harwood and S. M. cutting （ed.），molecular biological methods for Bacillus[M]. Chichester：John Wiley，1990：24-27.[5]Hirata H，Fukazawa T，Negoro S，et al. Structure of a beta-galactosidase gene of Bacillus stearothermophilus[J]. Journal of Bacteriology，1986，166（3）：722-727. Reference：为研究蜡样芽孢杆菌基因的转录调控特征，通过鸟枪法和蓝白斑筛选，获得57个蜡样芽孢杆菌启动子片段，并以β-半乳糖苷酶为报告基因，比较了这些启动子片段在大肠埃希菌中的转录活性。

对转录活性较高的4个启动子克隆片断进行测序、序列比对、特征分析，发现这4个克隆序列具有启动子元件、核糖体结合序列特征，其中2个克隆序列在枯草芽孢杆菌也表现出活性，表明兼有蜡样芽孢杆菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌RNA聚合酶σ因子序列识别特征Keys：启动子；随机克隆；蜡样芽孢杆菌；枯草芽孢杆菌Q933 ： A ：1002-1302（2014）04-0025-03收稿日期：2013-11-01基金项目：国家自然科学基金（编号：31272416）；石河子大学高层次人才科研启动专项（编号：RCZX201137）；石河子大学优秀青年项目（编号：2012ZRKXYQ13）作者简介：张婷婷（1984—），女，新疆石河子人，硕士，讲师，主要从事微生物生态研究E-mail：[email protected]通信作者：马磊，博士，副教授，主要从事生物信息学与分子遗传研究E-mail：[email protected]蜡样芽孢杆菌属兼性厌氧微生物，可产生毒素引发呕吐、腹泻等肠胃疾病，严重威胁食品业[1]和饲养业然而，蜡样芽孢杆菌也可分泌抗菌物质，抑制有害微生物生长，降解土壤中的营养成分，改良生态环境，其产生的细菌蛋白酶也可被用于麻脱胶、明胶液化、牛奶胨化、还原硝酸盐、水解淀粉等用途。

虽然蜡样芽孢杆菌典型菌株（ATCC14579）基因组已完成测序[2]，但目前对蜡样芽孢杆菌基因表达调控系统的研究较少，其内在丰富的遗传资源有待开发本研究利用蜡样芽孢杆菌（ATCC14579）基因组文库资源分离、筛选了多个蜡样芽孢杆菌启动子序列，分析了其在大肠埃希菌和枯草芽孢杆菌中的转录活性及序列特征，旨在为构建高效表达系统奠定基础，也为多宿主比较研究提供途径1材料与方法1.1材料菌株Bacillus cereus ATCC14579、B.subtilis DB104、Escherichia coli DH5α购自中国典型培养物保藏中心 （CCTCC）；质粒pE（来自pUC18，携带E.coli 质粒复制区起始，E.coli rep）、pGDV1（携带B.subtilis 质粒复制区起始，B.subtilis rep）、pDL（携带β-半乳糖苷酶基因，bgaB）为石河子大学生命科学学院实验室保存；质粒pEB（E.coli-B.subtilis穿梭载体）、pEB-bgaB 为本研究构建限制性核酸内切酶、碱性磷酸酶、T4 DNA连接酶购自Promage公司，Taq DNA聚合酶、LA Taq DNA聚合酶购自宝生物工程（大连）有限公司，质粒提取、DNA回收试剂盒购自杭州维特洁生化技术有限公司。

引物见表11.2方法1.2.1启动子探测载体的构建质粒pGDV1携带1段枯草杆菌质粒复制起始区（B.subtilis rep），通过PCR技术得到该序列（5′端设置BglⅡ位点，3′端设置SacⅠ位点）在质粒pE基础上，在BglⅡ、SacⅠ之间插入枯草杆菌质粒复制起始区（B.subtilis rep），构建大肠埃希菌-枯草杆菌穿梭载体pEB，酶切鉴定5），与枯草杆菌σA（σ43）识别序列-35区、-10区有较高同源性，因此其在枯草杆菌中可能由σA起始转录虽然C1、C2、C5可能具有同源性较高的-10区，但-35区不太典型3结论与讨论本研究构建了以β-半乳糖苷酶（bgaB）[5]为报告基因，在大肠埃希菌、枯草杆菌中均能稳定复制的启动子探测载体（图1）该载体所携带的bgaB基因不含启动子和核糖体结合序列，且在其起始密码子（ATG）上游具有多个酶切位点（NotⅠ、BamHⅠ、PstⅠ），有利于启动子序列的克隆操作以往研究中启动子克隆载体多以抗生素和绿色荧光蛋白（GFP）为报告基因，但是利用抗生素作为启动子筛选和检测指标，会因宿主菌产生的耐药性引起假阳性，检测数据高于真实值；利用绿色荧光蛋白对设备的要求比较高。

bgaB对宿主细胞生长影响较小，可特异性分解X-gal生成蓝色菌落，便于筛选本研究应用启动子随机克隆、蓝白斑筛选、β-半乳糖苷酶酶活检测，成功获得了4个在E.coli中具有较高转录、表达活性的蜡样芽孢杆菌启动子序列，而且其中2个还能在枯草杆菌中转录和表达，因此它们具有多宿主RNA聚合酶σ因子序列识别特征Reference：[1]Monika E S，Martina F，Siegfried S，et al. Bacilus cereus，the causative agent of an emetic type of food-borne illness[J]. Molecular Nutrition & Food Research，2004，48（7）：479-487.[2]Ivanova N，Sorokin A，Anderson I，et al. Genome sequence of Bacillus。