液相色谱质谱联用ppt课件.ppt

概 述LC-MS联用机遇与挑战LC ： 适用面广，但定性才干差MS： 定性才干强，但分析混合物时效果差LC-MS 经过LC的分别，使MS可以分析具有大量杂质的混合物中的待 测物，并提高分析的专注性和灵敏度； LC可以分别同分异构体，弥补了MS的缺乏  GC-MS : 样品必需气化 不适宜极性、热不稳定和大分子化合物〔20%〕 LC-MS：不挥发性化合物、极性化合物、热不稳定化合物和大分子化合 物(包括蛋白、多肽、多糖、多聚物等)，分析范围广 LC/MS 联用的主要困难 LC-MS 接口 (Interface)类型 API (atmosphere pressure ionization)ESI (electrospray ionization)APCI(atmospheric chemical ionization)热喷雾(TSP)、等离子体喷雾(PSP)、粒子束(LINC)和动态快原子轰击(FAB)等。

 Electrospray ionization(ESI) ESI 将溶液中的离子转变为气相离子,进展MS分析，最软的质谱离子化技术Tayler 锥(电泳机制〕 2~4kV0.1mm2 cm1、 液体外表带电2、带电雾滴构成3、雾滴蒸发4 、气相离子从微小的雾滴产生LC-MS 中常用电离技术 　　　不同外表张力溶剂的起始电位〔c ＝0.1mm, d=40mm)　　　　　　　　　ESI 所需电位为使Taylor发生静电喷雾，在毛细管尖端需施加的起始电位：　溶剂外表张力　Taylor 锥的半角0 真空介电常数c 毛细管半径 　　　ESI 实验条件优化１、待测物质在溶液中的形状〔溶液化学〕　　待测物质在供试品溶液中以离子形状存在，可提高生成气相离子的效率，提高检测灵敏度 B + RCOOH BH++RCOO- HA + NH3 A- +NH4+ 2、 溶剂的外表张力 纯水，因外表张力高，所需起始电位Uon高，易产生放电景象；　　 常用水－甲醇〔50:50)溶剂，同时黏度也下降，有利于雾化．3、 溶液流速 低流速产生细雾滴，有利于产生气相离子，提高信号灵敏度； 高流速范围内，为提高雾化效率，需采用高速同轴气流辅助雾化技术。

4、 雾滴的蒸发速率 提高 雾滴蒸发速率的方法：采用挥发性溶剂；提高“枯燥气〞温度和流速； 运用加热金属毛细管 5、 气相离子的产生 竞争机制——外表活性高〔最低溶剂化能〕的离子优先转移至雾滴外表， 最 终转变为气相离子，故有较高的实验灵敏度 1、 应采用外表活性低的缓冲剂 2、 采用低浓度的挥发性酸、碱及缓冲盐 3 、 用高纯度的溶剂、试剂 4、 样品应作预处置，除去干扰物及盐 Atmospheric chemical ionization (APCI) 样品溶液借助雾化气的作用，喷入高温〔如500℃〕蒸发器中，此时溶剂和溶质均为蒸气，由63Ni放射源或放电电极产生低能电子使试剂气，如N 2、O2、H2O、或溶剂B 等离子化，经复杂的一系列反响使溶质产生正或负离子 N2+e- N2+ +2e- A+BH + AH ++B (质子转移〕 A+B + A + +B(电荷转移〕　　　Ｍ＋Na +, M+NH4+、M+Ac-、 M+Cl-等。

APCI ： 适用于小分子极性较低的化合物〔醇、醚等〕ESI ： 热不稳定或难于气化的极性化合物ESI和APCI共同点:1、运用高电压元件和雾化气喷雾法产生离子2、通常产生(M+H)+或(M-H)-等准分子离子3、产生极少的碎片，但可以控制产生构造碎片４、非常灵敏的电离技术 不同点:1、生成离子的方式不同，ESI：液相离子化；APCI：气相离子化2、样品兼容性ESI：极性化合物和生物大分子,多电荷离子APCI：非极性，小分子化合物〔相对ESI而言〕且有一定挥发性， 要产生的是单电荷离子 基体辅助激光解吸电离(MALDI)　1988年，Hilenkamp 和Tanaka 发明，可将热不稳定分子完好地携带进入气相的离子化技术．操作过程：样品与基质〔1:100-50,000)均匀混合，点在样品靶子上，空气枯燥，送入离子源基质吸收激光能量-——基质离子——碰撞——样质量子化构成分子离子及分子离子的多聚体基体作用：1 在选定波长激光照射下，基体对激光能量有很强的吸收，而分析物普通只需很弱的吸收2 基体对分析物起到溶剂的作用，减少了分析物分子间的相互作用，减少了分析物簇群构成能够性。

3由于基体浓度远高于分析物，因此确保了激光大部分能量被基质吸收而最小限制地照射分析物4 基质常为有机弱酸，作为质子化试剂，在分析物离子的构成过程中具有重要作用LC-MS中的色谱技术20世纪80年代商品化，迅速成为运用最广泛的联用技术LC-ESIMS灵敏度影响要素： 质量型检测器：呼应与待测组分的质量流速成正比， 如FID、FPD 浓度型检测器： 检测器呼应与流动相中待测成分的浓度成正比如 UV、TCD APCI ：质量型检测器----------4.6mm i.d.色谱柱；　　　　ESI： 表观行为为浓度性检测器----------　细径色谱柱〔１mm i.d. 或更细〕；　　　　　　　　　　　　　　　　　进入喷雾器的质量流速；　　　　　气化样品离子　　　　　　　　　　　　　离子化效率　　　　　　可运用柱后分流，不会导致信号损失． LC-ESI MS技术2-25 m纯电喷雾熔融二氧化硅涂金1nL ~1 L/min低流速：低流速：LC-ESIMS流速选择流速选择毛细管液相色谱〔Cap-LC)和毛细管电泳〔CE)与MS联用；样品量有限、灵敏度优先思索时运用：　如肽图谱测定50-100 m1 ~200L/min 气动辅助〔离子喷雾〕中等流速：中等流速：微柱液相色谱与MS联用；适宜于既要高灵敏度又需求较大柱容量的任务：如药物代谢定性定量分析〔1~２.1mm)高流速：高流速：气动辅助＋热辅助500℃200 ~ 2mL/min雾滴周围的温度虽然有几百度，但当溶剂蒸发时，雾滴会冷却，其温度通常不超越　50℃，所以有机化合物不会热降解．样品量充足、可鉴定微量杂质：４.6mm i.d.　 如何将如何将HPLC 方法转化为方法转化为LC-ESIMS1、 缓冲剂 硫酸盐、磷酸盐及硼酸盐——醋酸铵、甲酸铵、三氟乙酸〔TFA〕、七 氟丁酸〔HFBA〕、氨水、氢氧化四丁基胺〔TBAH)等替代2、 pH 值　　通常应坚持不变3、离子对试剂 挥发性的如HFBA 、 TBAH，但保管时间有动摇4、有机溶剂 根本匹配5、色谱柱 离子交换柱〔高离子强度〕、蔬水相互作用色谱〔盐浓度梯度〕　6、 柱后修饰 作用： 调理pH值以优化正负离子检测；　　　　　 添加异丙醇以利于含水溶剂的去溶剂化、稀释缓冲盐； 添加醋酸钠〔50mol/L)使缺乏或只需弱质子化位点的样品阳离子化(Ｍ＋Ｎa+) 填充毛细管柱色谱或毛细管电泳，需在柱后添加适当溶剂〔补足液流〕以到达稳定的喷 雾，以提高质谱呼应。

安装： 三通、输液泵LC-API MS中的质谱技术ESI 和APCI 均为大气压离子化〔API〕技术，与经典的离子源不同，需求有从大气压至真空的接口及离子传输等安装1、电喷雾和高电压的衔接2 、喷雾针的位置和去溶剂方法带电雾滴进入质谱仪会撞击离子光学元件或质量分析器，产生离子脉冲，在质谱图中出现尖峰信号ESI 雾滴的去溶剂可采用热氮气流或加热取样毛细管〔防堵塞〕等方法3 、大气压离子源与真空的衔接-自在放射膨胀 M Mach碟与取样孔间隔碟与取样孔间隔D0 取样孔取样孔 内径内径 p0 上游〔大气压〕的压强上游〔大气压〕的压强 p1 下游〔真空〕的压强下游〔真空〕的压强4、簇离子问题 产生：APIMS 与LC、CE 等联用时，在离子源中有溶剂与水蒸气，由于自在放射膨胀 而迅速冷却，极性分子将与离子簇合 防止簇离子的产生-气帘 剥离簇离子上的溶剂分子-碰撞诱导解离〔collision induced dissociation, CID〕 在取样孔和取样锥〔或取样孔和离子光学元件〕之间加一电场，离子在电场作用下被加速。

簇合物与随机运动的背景气碰撞而被“加热〞，可导致氢键的断裂 假设电场较高，不仅剥离溶剂分子，而且也导致样品离子的裂解，这种由样品离子生成 碎片离子的技术称为源内〔in source )CID 分别大分子物质(如蛋白质)时,碰撞能分配在大量的振动自在度上,不会导致大分子的裂解. 5、仪器调调和质量坐标的校准 GC/MS PFTBA 〔全氟三丁胺〕 LC/APIMS ： 质量范围宽且分布均匀PEG 反复单元 CH2CH2O 生成一系列相差44u 的PEG+Na+离子NaI 用簇离子　Na+(NaI)n ，I- (NaI)n 　作为 校准物 生成一系列相差150u 的离子.。