神经退行性疾病的秀丽隐杆线虫模型研究进度.doc

神经退行性疾病的秀丽隐杆线虫模型研究进度=“news_bd”> 　　随着人口老龄化加剧，神经退行性疾病的发病率在近20年内上升了约20倍然而迄今为止，神经科学领域中的诸多问题仍未被解决，如神经退行性疾病的具体发病机制尚不明确，治疗方法仅限于控制病情而无法根治;复杂的心理学和行为学因素参与了神经元和神经网络的调节，遗传和环境等因素对其影响尚不可知;相关的治疗药物也层出不穷因此建立适合的实验动物模型、筛选出高效的药物是当务之急　　由于高等动物实验模型的神经系统结构和功能存在一定的复杂性，在研究过程中会出现诸多干扰因素秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)以其结构简单、生命周期短、易于培养以及与42%的人类疾病基因存在相关性等独特优势，已成为研究神经退行性疾病机制的良好在体模型，因此将简单的模式生物秀丽隐杆线虫作为神经系统疾病研究的切入点，展开深入研究，对理解神经退行性疾病发生发展规律具有重要意义，现就相关研究综述如下　　秀丽隐杆线虫及其神经系统介绍　　秀丽隐杆线虫属于线形动物门线虫纲动物，其为低等无脊椎动物秀丽隐杆线虫通常生活在土壤中，易人工养殖，以大肠杆菌OP50为食，无寄生性。

秀丽隐杆线虫有雌雄同体和雄性两种性别，在自然界中主要以雌雄同体为主野生型秀丽隐杆线虫株系N2在20℃培养温度下可发生自体繁殖，这种自我繁殖的能力有利于得到具有同一基因型的纯合体，一生产卵可达300个，生长周期短为3d左右，经历幼虫期(L1、L2、L3、L4)和成虫期，生命周期长约20d左右，逆环境条件下(如高温、拥挤或饥饿)可进入dauer期(抵抗逆环境的状态)成虫长度约1-2mm，通体透明，其能像细菌一样在-80℃冰箱长期保存，它有味觉和嗅觉，并能感受光、接触、温度、化学物质、离子等刺激线虫的神经信号传导系统具有高度的保守性，并且线虫中存在超过42%的人类疾病相关基因　　秀丽隐杆线虫有959个体细胞，其中包括302个神经元，56个胶质细胞根据其形态差异，可将302个神经元分为118种类型;根据其功能差异，又可将其分为感觉神经元、中间神经元、运动神经元秀丽隐杆线虫包含多种与人类相关的神经递质，如乙酰胆碱、多巴胺、5-羟色胺、谷氨酸、γ-氨基丁酸和神经肽等，且其在神经元中的合成、储存和代谢等过程与哺乳动物也具有高度相似性秀丽隐杆线虫所具有的大多数离子通道基因与哺乳动物也具有同源性。

秀丽隐杆线虫的神经退行性疾病模型　　1. 阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease，AD)秀丽隐杆线虫　　模型 AD是现今人类第一大神经退行性疾病，其为一种渐进性神经退行性疾病AD的临床表现为进行性记忆功能受损、认知功能障碍及行为状况改变、语言功能受损，最终导致生活不能自理直至死亡，其病理特征主要表现为神经细胞外由β淀粉样蛋白(Aβ)异常沉积形成淀粉样老年斑(amyloid plaques)和神经细胞内tau蛋白自聚集出现神经纤维缠结(neuro fibrillarytangles，NFTs)目前，已有多种模式生物被应用于AD的研究，秀丽隐杆线虫也位列其中现阶段已被建立的秀丽隐杆线虫AD模型多为转基因模型：Aβ模型和tau模型　　1.1 Aβ模型 Aβ是APP经β分泌物和γ分泌物剪切后形成的，首先被β分泌酶在671位点水解，再由γ-分泌酶对711-713位点进行水解，则产生由39-43个氨基酸残基构成的Aβ，并在AD脑内出现异常释放和沉积，形成老年斑(SP)随着研究者们对研究的不断深入，越来越多的证据表明Aβ在AD的发生和发展过程中起到主导作用。

由于秀丽隐杆线虫中不存在β-分泌物的类似基因，转入人的APP基因后不能自行产生Aβ，故目前建立的模型主要是转Aβ基因模型早在1995年，Link C D等最先建立了转Aβ1-42基因的模型CL2006，该模型在培养2d左右出现细胞内Aβ沉积以及进行性麻痹的表型，但并没有直接的AD的病理特征出现因此，研究者们又提取AD患者死后脑组织中的RNA，并对其进行RT-PCR研究，验证在秀丽隐杆线虫中所筛选到的人同源基因的表达情况，发现Aβ晶状体蛋白基因(CRYAB)和肿瘤坏死因子诱导蛋白(TNFAIPI)基因在AD病人中的表达确实提高与此同时，Boyd-Kimball D等和WU Y等在对Aβ1-42进行研究时，发现其在转基因线虫的神经元和突触小体中发生了蛋白质氧化和脂质过氧化反应，并从中发现了16种氧化形式的蛋白质，进一步证明蛋白质氧化参与Aβ诱发的神经退行性病变的过程虽然在神经细胞特异性启动子控制Aβ表达的转基因秀丽隐杆线虫细胞内出现Aβ沉积，但没有观察到总体运动方面的变化因此，理论上在神经细胞中Aβ过表达的模型更接近AD。

目前在秀丽隐杆线虫建立的Aβ模型　　1.2 tau模型 AD的另一个主要的病理特征表现为神经纤维缠结，这主要是由tau表达增多和异常磷酸化引起的，tau表达增多主要体现在可溶性的tau在转变为寡聚体和纤维丝的过程中发生聚集，产生毒性;而tau异常磷酸化则是由蛋白激酶和蛋白磷酸酶的调节失衡引起的以上两者在AD病理的发生过程中均起到重要作用，常被应用于AD的临床检测Hikishima K等通过在秀丽隐杆线虫中转入神经细胞特异性过表达的人P301L和V337M来建立野生型和FTDP突变型的tau转基因模型，发现两者中tau的过表达均会出现运动不协调(UNC)表型Brunden K R等在秀丽隐杆线虫中建立触觉神经细胞特异性过表达人tau的野生型(N2)和突变型的转基因模型，结果发现过表达tau的野生型线虫有轻微的触觉反应性下降，而过表达tau的转基因秀丽隐杆线虫模型则表现出明显的触觉反应下降以及在突触神经元胞体和神经突起有tau的沉积，在体式荧光显微镜下能观察到与人类神经退行性疾病类似的神经病理学和行为学特征　　2. 帕金森症(Parkinson disease，PD)线虫模型　　PD是继AD之后的第二大神经退行性疾病，以黑质-纹状体中多巴胺能神经元的变性缺失和胞质内包涵体——路易小体的出现为病理特征;以震颤、运动迟缓、肌肉强直和动作姿势异常为主要的临床表现。

目前分子水平的研究表明，PD的发生与多种基因相关，如α-Synuclein、PARKIN、PINK-1、PARK2、LRRK2、线粒体相关基因、泛素-蛋白酶体通路相关基因、溶酶体相关基因等迄今为止，PD的发病机制尚不明确，可能与遗传因素和环境因素存在一定的相关性[16]左旋多巴是目前治疗PD较为有效的药物，但其存在一定的弊端因此，建立PD模型，并对其发病机制进行深入研究是很有必要的现阶段，利用秀丽隐杆线虫建立PD模型主要有两种方式：药物诱导模型、转基因模型　　2.1 药物诱导模型 药物诱导模型是通过神经毒素染毒获得，如重金属Mn、Hg，百草枯(paraquat，PQ)，鱼藤酮，MPTP(1-甲基-4-苯基-四氢吡啶)，MPP+(1-甲基-4-苯基吡啶盐离子，1-methyl-4-phenylpyridine)和6-羟基多巴胺均可通过选择性诱导多巴胺能神经元凋亡，导致秀丽隐杆线虫的运动能力下降、死亡数增加　　2 . 1 . 1 P Q 模型：P Q 通过破坏体细胞的防御机制，从而达到氧化应激损伤的目的线虫生活在0 . 3 m m o l / LP Q的环境中，P Q 进入线虫体内，消耗大量的N A D P H，使NADPH参与的生化反应不能正常进行，同时，竞争性抑制并干扰呼吸链的电子传递，影响氧化磷酸化，使得一些电子与分子氧作用形成超氧阴离子(O2-)，O2-很快被超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)转化成过氧化氢(H2O2)，后者被过氧化氢酶(catalase, CAT)转化成 H2O。

此外，H2O2也可以通过粒体和细胞质之间的自由扩散，形成羟自由基(OH•)和氢氧根离子(OH-)等更多的自由基，从而导致氧化应激损伤，诱发PD　　2.1.2 MPTP/MPP+模型：MPP+为MPTP的活性代谢产物，其毒性作用强于MPTP早在1982年，就有研究表明人体摄入过量的MPTP可产生酷似PD的症状，其作用机制是MPTP通过血脑屏障后，在神经胶质细胞中的单胺氧化酶的作用下转化为MPP+，对中脑黑质多巴胺能神经元进行选择性破坏，从而诱发PDBraungart E等[17]将野生型秀丽隐杆线虫(N2)置于加有1.0mmol/L MPP+的96孔板中，发现其活动度降低，出现死亡为了进一步证明MPP+造成的损伤位于DA，用已知损伤剂量的MPP+对Pcat-2∶∶GFP进行损伤，在体式荧光显微镜下观察其DA处的变化，并给予适量的阳性对照药物麦角乙脲、左旋多巴，可观察到秀丽隐杆线虫的以上表型得以到明显缓解　　2.1.3 Mn2+模型：Mn2+不仅是人体维持大脑正常发育所必需的，还是多种酶发挥正常生理作用所必需的，例如锰超氧化物歧化酶和谷氨酰胺合成酶但高浓度的锰可引起如强直、震颤、肌张力障碍运动和运动迟缓等锥体外系反应。

Aitlhadj L等[18]在流行病学的研究中已证实Mn2+与PD有关经研究发现，秀丽隐杆线虫(N2)如短期暴露于Mn2+中，会造成多巴胺能神经元死亡率的增加然而，这一特点与PD的症状很相近为了更直观的观察秀丽隐杆线虫的多巴胺能神经元经Mn2+损伤后的状态，Harrington A J等以Pdat-1::GFP作为损伤模型，可以观察到经Mn2+损伤的线虫的多巴胺能神经元处的绿色荧光减弱　　2.1.4 6-OHDA模型：Harrington A J等经研究发现，借由秀丽隐杆线虫通体透明这一特点，在其神经元或突触上注入荧光蛋白，可以直接观察到神经元细胞凋亡或者其他异常变化的情况，故使用6-OHDA对秀丽隐杆线虫Pdat-1::GFP株系进行损伤，出现明显的多巴胺神经能的退化，即GFP斑点缩小2.2 转基因模型　　2.2.1 人源α-Synuclein(α-Syn)转基因模型：即通过过量表达人源α-Syn，诱导秀丽隐杆线虫的神经元和树突损伤来模拟PDHarrington A J等经过研究发现，α-Syn是构成路易小体的最主要蛋白，PARK1编码α-Syn，PARK1的变异或者过表达均可以导致遗传性的PD。

通过人类基因组分析，还有8个基因与PD相关，分别是PARK2、PARK5、PARK6、PARK7、PARK8、PARK9、PARK11以及PARK13这些基因中的6个虫中都有与之对应的基因，但是没有编码α-Syn的基因然而PD的主要病理特征为路易小体的聚集，所以以秀丽隐杆线虫建立PD的转基因模型应该以α-Syn蛋白表达以及其产生的毒性为考察指标由于秀丽隐杆线虫自身不能表达α-Syn蛋白，所以，通常采用人源的α-Syn基因去建立转基因秀丽隐杆线虫的α-Syn病理模型Lakso M等建立了过表达人源α-Syn的野生型和A53T突变的线虫模型，分别利用了aex-3、dat-1、unc-30以及acr-24种不同的启动子野生型和A53T的α-Syn在全部神经元或者运动神经元的表达可以导致运动功能障碍，但是在多巴胺神经元中的表达不可以导致运动功能障碍，继而发现利用aex-3和dat-1作为启动子表达野生型和A53T的α-Syn可以导致多巴胺神经元的减少Karpinar D P等[23。