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    各种染色法    苏木精—伊红染色法（HE染色法）石蜡切片技术里常用的染色法之一苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色细胞核被苏木精染成鲜明的蓝色，软骨基质、钙盐颗粒呈深蓝色，粘液呈灰蓝色细胞浆被伊红染成深浅不同的粉红色至桃红色，胞浆内嗜酸性颗粒呈反光强的鲜红色胶原纤维呈淡粉红色，弹力纤维呈亮粉红色，红血球呈橘红色，蛋白性液体呈粉红色着色情况与组织或细胞的种类有关，也随其生活周期及病理变化而改变例如，很多细胞在新生时期胞浆对伊红着色较淡或轻度嗜碱，当其衰老时或发生退行性变则呈现嗜伊红浓染胶原纤维在老化和出现透明变性时，伊红着色由浅变深活体染色活体染色是指一个获得动物或植物的细胞活组织被染色至于体外活体染色是指也获得动物或植物分离出来的一部分细胞活一部分组织被一种活体染色剂染色而不影响细胞活组织的生命活体染色与体外活体染色的主要区别：活体染色是在有机体内部，因此不在空气中而是在还原的环境中进行的，至于体外活体染色是在空气中，在氧化的环境中进行的所以一种真正的活体染色剂就是在一种生物的活细胞的某种构造上面的染料，但对于细胞、对于组织和对于生命本身不发生任何有害的作用。

活体染料多为碱性染料，如中性红、健那绿、次甲基蓝、甲苯胺蓝、亮焦油紫等，它们解离后带正电，其中有的染料与胞内某些结构有专一性接合例如，中性红染液泡系，健那绿染线粒体DNA-Feulgen染色方法是DNA定量测定的主要染色方法之一其具体反应原理是，标本经稀盐酸水解后，DNA分子中的嘌呤碱基被解离，从而在核糖的一端出现了醛基Schiff试剂中的无色品红可与醛基反应，形成含有醌基的化合物分子, 因醌基为发色团，故可呈现出紫红色也就是说, DNA经稀酸水解后产生的醛基，具有还原作用，可与无色品红结合形成紫红色化合物，从而显示出DNA的分布2HCl+Na2S2O5→2NaCl+SO2+H2SO3DNA是主要的遗传物质，集中于染色体上孚尔根染色法的反应原理主要与席夫试剂的化学性质有关，此试剂的基本成分是碱性品红，偏亚硫酸氢钠(NaHSO3)和盐酸.碱性品红的主要成分是三氨基三苯甲烷氯化物碱性品红原为桃红色，当与亚硫酸作用时被氧化，使醌型变为苯型，由桃红色变为无色透明的N-亚磺酸亚硫酸副品红碱，当它与醛基作用时，其分子式又恢复为醌型结构，呈现紫红色利用1N HCl 、60℃下水解时，可将DNA分子中嘌呤碱基与去氧核糖之间的糖苷键打断，使嘌呤脱下，并使去氧核糖C-1位置释放醛基与席夫试剂反应显紫红色。

细胞中只有DNA才具有这种专一的孚尔根反应，因此利用孚尔根反应，可以鉴定DNA的存在并广泛应用于核及染色体的研究中吖啶橙染色它与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，可发出不同颜色的荧光，与DNA结合量少发绿色荧光，与RNA结合量多发桔黄色或桔红色荧光该染料具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA 和RNA染色因此，在荧光显微镜下观察，吖啶橙可透过正常细胞膜，使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光；而在凋亡细胞中，因染色质固缩或断裂为大小不等的片断，形成凋亡小体吖啶橙使其染上致密浓染的黄绿色荧光，或黄绿色碎片颗粒；而坏死细胞黄荧光减弱甚至消失吖啶橙AO常与溴化乙啶EB合用双染，因EB只染死细胞使之产生桔黄色荧光，由此可区分出正常细胞、凋亡细胞及坏死细胞.它还可以用作移码突变的诱变剂,能镶嵌于两个相邻的碱基对之间，这样在DNA复制过程中，会使DNA链增加或缺失一个碱基，造成移码突变吖啶橙染液有毒，操作时要戴手套，需避光瑞氏染色法瑞氏染料：由酸性染料伊红（E-）和碱性染料亚甲蓝（M+）组成伊红通常为钠盐，有色部分为阴离子亚甲蓝（又名美蓝）为四甲基硫堇染料，有对醌型和邻醌型两种结构通常为氯盐，即氯化美蓝，有色部分为阳离子。

美蓝容易氧化为一、二、三甲基硫堇等次级染料（即天青）将适量伊红、美蓝溶解在甲醇中，即为瑞氏染料甲醇的作用：一是溶解美蓝和伊红；二是固定细胞形态染色原理：既有物理的吸附作用，又有化学的亲和作用各种细胞成分化学性质不同，对各种染料的亲和力也不一样如血红蛋白、嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结合，染粉红色，称为嗜酸性物质；细胞核蛋白、淋巴细胞、嗜碱性粒细胞胞质为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色或蓝色，称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫红色，称为嗜中性物质、原始红细胞、早幼红细胞胞质、核仁含较多酸性物质，染成较浓厚的蓝色；中幼红细胞既含酸性物质，又含碱性物质，染成红蓝色或灰红色；完全成熟红细胞，酸性物质彻底消失后，染成粉红色姬姆萨染色染前用蛋白酶等进行处理，然后再用姬姆萨染液染色，在染色体上，可以出现不同浓淡的横纹样着色初染剂结晶紫进行初染，再用碘液媒染，然后用乙醇(或丙酮)脱色，最后用复染剂(如番红)复染经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色(红色)，该菌属于革兰氏阴性菌革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。

实际上，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇(或丙酮)脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇(或丙酮)溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色最适于血液涂抹标本，用以染血球、疟原虫、立克次体以及骨髓细胞、脊髓细胞等的染色芽孢染色法芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲合力不同的原理，用不同染料进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难，因此，当先用一弱碱性染料，如孔雀绿（malachite green）或碱性品红（basicfuchsin）在加热条件下进行染色时，此染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出，若再用复染液（如番红液）或衬托溶液（如黑色素溶液）处理，则菌体和芽孢易于区分。

革兰氏染色法细菌先经碱性染料结晶染色，而经碘液媒染后，用酒精脱色，在一定条件下有的细菌此色不被脱去，有的可被脱去，因此可把细菌分为两大类，前者叫做革兰氏阳性菌（G+），后者为革兰氏阴性菌（G—）为观察方便，脱色后再用一种红色染料如碱性蕃红、稀释复红等进行复染阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色有芽胞的杆菌和绝大多数的球菌，以及所有的放线菌和真菌都呈革兰氏正反应；弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽胞杆菌都呈现负反应革兰氏阳性菌对青霉素敏感，革兰氏阴性菌对链霉素敏感可根据革兰氏染色法鉴别不同菌种并对症下药革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在化学组成和生理性质上有很多差别，染色反应不一样现在一般认为革兰氏阳性菌体内含有特殊的核蛋白质镁盐与多糖的复合物，它与碘和结晶紫的复合物结合很牢，不易脱色，阴性菌复合物结合程度底，吸附染料差，易脱色，这是染色反应的主要依据另外，阳性菌菌体等电点较阴性菌为低，在相同PH条件下进行染色，阳性菌吸附碱性染料很多，因此不易脱去，阴性菌则相反所以染色时的条件要严格控制例如，在强碱的条件下进行染色，两类菌吸附碱性染料都多，都可呈正反应；PH很低时，则可都呈负反应此外，两类菌的细胞壁等对结晶紫—碘复合物的通透性也不一致，阳性菌透性小，故不易被脱色，阴性菌透性大，易脱色。

所以脱色时间，脱色方法也应严格控制PAS染色法PAS染色又称过碘酸雪夫染色，反应用来显示糖元和其它多糖物质操作步骤1. 固定液:用Carnoy液或75%酒精Carnoy固定液: 纯酒精60 ml 冰醋酸 10ml 氯仿 30ml2. 染色液1) 过碘酸酒清夜配法:过碘酸(HIO .2H O) 0.4g 95% 酒精 35ml M/5醋酸钠(2.72g+蒸馏水100ml) 5ml蒸馏水10ml保存于冰箱内,用棕色瓶,可用两周.2) Schiff氏液:0.5克碱性品红加入100毫升蒸馏水中,时时摇动三角瓶5分钟,使之充分溶解.冷却至50℃后过滤,加入10毫升1N盐酸.冷却至25℃,加入0.5-1克偏重硫酸钠,在室温中至少静置24小时,然后密封冰箱保存.3) Schiff氏酒精液配置 Schiff氏液 11.5ml 1N HCI 0.5ml 纯酒精 23ml4) 亚硫酸水1%偏重亚硫酸钠 10ml 1N HCI 10ml 蒸馏水 180ml的树胶溶解苏丹Ⅲ染色苏丹Ⅲ(Sudan Ⅲ或Ⅳ) 能使木栓化,角质化的细胞壁及脂肪,挥发油,树脂等染成红色或橙红色.Van Gieson苦味酸酸性复红法(VG法)用途：VG法用于区分胶原纤维和肌纤维。

原理：酸性复红和苦味酸对这两种纤维都具有较强的亲合力，结果胶原纤维被酸性复红染成红色，肌肉被苦味酸染成黄色此方法是一种优良的传统方法固定：10%福尔马林切片：4-6微米试剂：Weigert铁苏木精液：A液：苏木精1g，无水酒精100 ml一般配制后需要数周或数月自然氧化，成熟后使用B液：29%三氯化铁水溶液4 ml，蒸馏水95 ml，盐酸1 ml两液分别配制，临用时A、B液等量混合，过滤后使用24h后失去染色能力Van Gieson液：1%酸性复红水溶液10 ml苦味酸饱和水溶液90 ml临用时1:9混合过虑后使用Van Gieson苦味酸酸性复红法(VG法)步骤：1．石蜡切片脱蜡至水2．Weigert苏木精液5-10 min3．充分水洗4．Van Gieson液1-5 min5．95%酒精迅速分化数秒6．无水酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封固结果：胶原纤维呈红色、肌肉、神经胶质、胞浆、红血球呈黄色、细胞核呈黑色或棕蓝色体会与说明：由于酸性复红退色较快，染色结果不能长期保存，一般只能保存3～6个月Masson三色法试剂：Regaud 氏苏木精：苏木精1g，95%酒精10ml，甘油10ml，蒸馏水80ml。

将苏木精加入蒸馏水内加温溶解,冷却后加入酒精和甘油,放数日后即可应用Masson丽春红酸性复红液：丽春红0.7g，酸性复红0.3g，蒸馏水99ml，冰醋酸1ml0.2%冰醋酸水溶液：冰醋酸0.2 ml，蒸馏水100 ml1%磷钼酸水溶液：磷钼酸1g，蒸馏水100 ml苯胺蓝水溶液：苯胺蓝2g，蒸馏水98 ml，冰醋酸2 ml1%光绿水溶液：光绿1g，蒸馏水100 mlMasson三色法步骤1．石蜡切片脱蜡至水2．铬化处理或去汞盐沉淀（甲醛固定的组织此步可略）3．依次自来水和蒸馏水洗4．用Regaud苏木精染液或Weigert苏木精液染核5-10min5．充分水洗,如过染可盐酸酒精分化6．蒸馏水洗7．用Masson 丽春红酸性复红液5-10min8．以2%冰醋酸水溶液浸洗片刻9．1%磷钼酸水溶液分化3-5min10．不经水洗,直接用苯胺蓝或光绿液染5min11．以0.2%冰醋酸水溶液浸洗片刻12．95%酒精、无水酒精、。