实验室常用菌株及特性.doc

一、实验室常见菌株简介XI1-Blue 菌株基因型：endA1 gyrA96(naIR) thi-1 recAI relAI lac glnV44 F?[Tn10 proAB+ laclq △ (lacZ)M15] hsdR17(rK mK+)特点：具有卡那抗性、四环素抗性和氯霉素抗性用途：分子克隆和质粒提取BL21(DE3)菌株基因型：F-ompT gal dcm Ion hsdSB(rB- mB-)入(DE3 [lacI lacUV5T7 gene 1 ind1 sam7 nin 5])特点：该菌株用于以T7 RNA聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主 T7噬菌体RNA聚合酶基因的表达受控于 入噬菌体DE3区的lacUV5启动子，该 区整合于BL21的染色体上该菌适合于非毒性蛋白的表达用途：蛋白质表达BL21(DE3)ply 菌株基因型：F- ompT gal dcm Ion hsdSB(rB- mB-)入(DE3) pLysS(cR)特点：该菌株带有pLysS,具有氯霉素抗性此质粒还有表达T7溶菌酶的基因， T7溶菌酶能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰 IPTG诱导的表达。

适合于毒性蛋白和非毒性蛋白的表达用途：蛋白质表达DH5a菌株基因型：F- endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG ① 80dlacZ △ M15△ (lacZYAargF)U169, hsdR17(rK-,入-特点：一种常用于质粒克隆的菌株 其①80dlacZ △ M1基因的表达产物与pUC 载体编码的伕半乳糖苷酶氨基端实现a互补，可用于蓝白斑筛选recA1和endA1 的突变有利于克隆DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取用途：分子克隆、质粒提取和蛋白质表达JM109菌株基因型：en dA1 gl nV44 thi-1 relA1 gyrA96 recA1 mcrB+ △ (proAB) e14-[F? traD36 proAB+ lacIq lacZ △ M15]hsdRriK+J<特点：部分抗性缺陷，适合重复基因表达，可用于M13克隆序列测定和蓝白斑 筛选用途：分子克隆、质粒提取和蛋白质表达DH10B菌株基因型：F- mcrA △ (mr-hsdRMS-mcrBC)① 80dlacZ △ M15 △ lacX74 endA1 recA1 deoR△ (ara,leu)7697 araD139 galU galK n upG rpsL- 入The most widely used E. coli strain for BAC cloning is DH10B。

host for pUC and other -complementation vectors; pBR322useful for gen erati ng geno mic libraries containing methylated cytos ine or ade nine residues useful for plasmid rescue proceduresELECTROMAX DH10B T1 CELLS说明：DH10B细胞是高转化效率的E. coli，可以完美应用于大多数实验应用DH10B基因型具有以下特点：lacZ △ M15用于重组克隆的蓝/白斑筛选消除了 mcrA、mcrBC、mrr和hsdRMS限制系统，允许构建更多具有代表性的 基因组文库（1,2）endA1突变，可以增加质粒产量和数量?高效率转化大小为150 kb的质粒，用于产生cDNA或基因组文库DH10B?可以表达tonA的基因型，tonA能够提供对T1和T5噬菌体感染的抗性 (DH10B? T1R)DH10B 的基因型：F • mcrA △ (hsraiRMS-mcrBC) © 80lacZ △ M15 △ lacX74 recA1 en dA1 araD139 △ (ara, leu)7697 galU galK 入• rpsL (StrR) nupGDH10B T1R 的基因型：F • mcrA △ (hsdRMS-mcrBC) © 80lacZ △ M15 △ lacX74recA1 endA1 araD139△ (ara, leu)7697 ggdUK 入rpsL (StrR) nupG tonARosetta(DE3)菌株RosettaTM宿主茵是BL21情生菌.罷啊显增强带有大肠杆菌稀有常码子旳真核蛊白的責达“谨菌秣通过一亍招容怪氯宥棄抗席质粒补充密码予AU久AGG* AGA. CUA. CGCGGA的tRNAb这样Rosetla 株实现T 万魅”的制译"而一胺情况下：由于受大肠杆萌密码于使用狈率旳眠制.真核奄白憲达常有宙难MFINA茶因由它们的犬然启动于駆动、在 Rosetta (DE3) pLysS W Rosetta [DE3) pLacI 中，稀有 tRNA $ 因存在于分别带有无黄口表达E. coli |KJ 咚码子fli袴性补充移有幌碍子的tRNAt带持肓汽码子F谨内号疋入肠血兰窃码FRosetta 2Rosetts-g曰mi 2 RDsetta-gami B RcsettaBlue岀现戡蛊董口僦键形成因•降低栖4把属封还專件：利用促富二帆謹朋战的各种ftUftSOrlgannl 2Roseita-^ami £Rcsetta-gami B表达迪快.表达控制优化表达水平：降涼 沪TG敞度优比TunerRcs^tts-^ami B蚩口无清性蚩白帽渥折叠降低和主葩血的证原性：利用促进二建■弱威豹各种義体标签Origami 2Rosetta-gam i 2 RoseHs-gaml B控制优化表达水平:隆■. IPTG谊嵐优化TunerRoseHs^iairrii B堀胞死亡，生离性蛍口更严宿的本底表达抨制pLy$S商株无丸隆生M过岛本直襄达更严格的本底震达控削pLysS> pLysE曲-株首先来一些大肠杆菌表达的基本概念： 一个完整的表达系统通常包括配套的表达载体和表达菌株，如果是特殊的诱导表达还包括诱导剂，如果是融合表达还包括纯化系统或者 Tag检测等等。

选择表达系统通常要根据实验目的来考虑，比如表达量高低， 目标蛋白的活性，表达产物的纯化方法等等主要归结在表达载体的选择上表达载体：我们关心的质粒上的元件包括启动子，多克隆位点，终止密码，融合 Tag （如果有的话），复制子，筛选标记 /报告基因等通常，载体很贵，我们可以通过实验室之间交 换得到免费的载体但是要小心，辗转多个实验室和多个实验室成员之手的载体是否保持原 来的遗传背景？ MCS是否还是原来那个 MCS ?是我们要特别注意的复制子：通常表达载体都会选用高拷贝的复制子 PSC101类质粒是严谨方式复制，拷贝数低，pCoEl，pMBI（pUC）类的复制子的拷贝数高达 500以上，是表达载体常用的通常情况 下质粒拷贝数和表达量是非线性的正相关， 当然也不是越多越好， 超过细胞的承受范围反而 会损害细胞的生长如果碰巧需要 2个质粒共转化，就要考虑复制元是否相容的问题筛选标记和报告基因：氨苄青霉素抗性是最常见的筛选标记，卡那霉素或者是新霉素次之， 通常是另一个载体的筛选标记用 四环素，红霉素和氯霉素等已经日渐式微 抗性基因的选择要注意是否会对研究对象产生干扰， 比如代谢研究中要留意抗性基因编码的酶是否和代谢物相互作用。

在表达筛选中要注意的问题应该就是 LB倒板前加抗生素的温度，温度过高容易导致抗生素失效今天耐青霉素的超级细菌泛滥，不知道是否有我们实验人员的功劳呢？ 大家—I便倒掉I已经获得氨苄抗性的大肠杆菌之前有没有经过煮沸或者消毒等处理呢？从 以前的一针50万单位到现在100多万个单位，青霉素剂量似乎越来越大了对于做表达来说，如果不是要研究启动子的强弱，通常比较少关心或者用到报告基因吧 绿色荧光蛋白是最常用的报告基因了（注意选择适用原核表达版本的 GFP）,其他还有半乳糖苷酶啊，荧光素酶啊等等一些融合表达 Tag也有报告基因的功能启动子、终止子和核糖体结合位点启动子：启动子的强弱是对表达量有决定性影响的因素之一 从转录模式上看有组成型表达和诱导调控型表达lac和Tac, PL和PR, T7是最常用的启动子，生物通在下面和后继的 文章中会逐一介绍组成型表达：表达载体的启动子为组成型启动子， 也就是一直努力不停表达目的蛋白的启动子，如pMAL系统持续性表达通常表达量比较高，成本低，但是不适合表达一些对宿主 细菌生长有害的蛋白 因为过量或者有害的表达产物会影响细菌的生长， 反过来影响表达量的积累诱导调控型表达：表达载体采用诱导型启动子， 只有在诱导剂存在的条件下才能表达目的产物。

这种方法有助于避免菌体生长前期高表达对菌体生长的影响， 又可减少菌体蛋白酶对目标产物的降解特别适合解决有毒蛋白的表达 另外也有启动子是组成型的， 但是启动子所依赖的转录酶是诱导表达的，也属于诱导表达系统融合表达：表达载体的多克隆位点上有一段融合表达标签 （Tag）,表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测对于特别小的分子建议用较 大的Tag（如 GST）以获得稳定表达；而一般的基因多选择小 Tag以减少对目的蛋白的影响His-Tag是最广泛采用的 Tag分泌表达：在起始密码和目的基因之间加入信号肽， 可以引导目的蛋白穿越细胞膜， 避免表达产物在细胞内的过度累积而影响细胞生长， 或者形成包含体，而且表达产物是可溶的活性状态不需要复性通常这种分泌只是分泌到细胞膜和细胞壁之间的周质空间可溶性表达：大肠杆菌表达效率很高，特别是强启动子，目的蛋白来不及折叠而形成不溶的 包含体颗粒，包含体容易纯化但是复性效率不高 分泌表达可以得到可溶的产物， 也有部分融合Tag有助于提高产物的可溶性，比如 Thio , pMAL系统转录终止子对外源基因在大肠杆菌中的高效表达有重要作用 一一控制转录的RNA长度提高稳定性，避免质粒上异常表达导致质粒稳定性下降。

放在启动子上游的转录终止子还可以防止其他启动子的通读，降低本底转录终止子有两类， Rho因子作用下使转录终止 mRNA和根据模版上的对称序列形成发夹结构而终止 mRNA常见的是rrnB rRNA操纵子的T1T2串连转录终止子核糖体结合位点：启动子下游从转录起始位点开始延伸的一段碱基序列， 其中能与rRNA16S亚基3'端互补的SD序列对形成翻译起始复合物是必需的，多数载体启动子下游都有 SD序列，也有些载体没有，适合自带 SD序列的基因表达，要留意表达菌株：我们往往最容易忽视的一点 不同的表达载体对应有不同的表达菌株， 一些特别 设计的菌株更有助于解决一些表达难题， 这一点生物通会有专门的介绍 同样的，交换获得 的免费菌株，要小心其遗传背景是否已经发生改变？当心注：以上各种特性是可以相互组合的，不是排他的！几个常用的启动子和诱导调控表达系统最早应用于的表达系统是 Lac乳糖操纵子，由 启动子Plac +操纵基因lacO +结构基因组成其转录受 CAP正调控和lacI负调控lacUV5突变能够在没有 CAP的存在下更有效地起始转录，该启动子。