基因组学课件基因组序列的诠释.ppt

中英联合实验室中英联合实验室5 基因组序列的诠释基因组序列的诠释1中英联合实验室中英联合实验室2中英联合实验室中英联合实验室问问 题题基因组序列所包含的全部遗传信息是什么？基因组序列所包含的全部遗传信息是什么？基因组作为一个整体如何行使其功能？基因组作为一个整体如何行使其功能？用什么方法寻找基因，研究基因的功能呢？用什么方法寻找基因，研究基因的功能呢？3中英联合实验室中英联合实验室基因组序列的诠释基因组序列的诠释n研究基因组的最终目的不是为了仅仅得到基因研究基因组的最终目的不是为了仅仅得到基因组的组的全部序列全部序列，而是诠释基因组所包含的，而是诠释基因组所包含的信息信息和基因组和基因组功能功能在这一部分中，我们主要探讨在这一部分中，我们主要探讨利用什么方法来搜寻基因和研究基因组的功能利用什么方法来搜寻基因和研究基因组的功能n1. 在基因组中搜寻基因在基因组中搜寻基因u根据顺序分析搜寻基因根据顺序分析搜寻基因u实验分析确认基因实验分析确认基因n2. 基因功能的测定基因功能的测定4中英联合实验室中英联合实验室A  起始密码子起始密码子 ATG B  信号肽分析信号肽分析C  终止密码子终止密码子D  3’端的确认端的确认E  非编码序列、内含子非编码序列、内含子F  密码子偏爱性密码子偏爱性G  外显子－内含子边界外显子－内含子边界H  上游调控序列上游调控序列I   软件预测软件预测5.1 在基因组中搜寻基因在基因组中搜寻基因根据序列分析搜寻基因根据序列分析搜寻基因5中英联合实验室中英联合实验室5.1 在基因组中搜寻基因在基因组中搜寻基因n在获得基因组或在获得基因组或DNA序列后，可以采用人工或计算机序列后，可以采用人工或计算机序列筛选的方法来获得基因。

目前，使用比较多的方序列筛选的方法来获得基因目前，使用比较多的方法是法是ORF（（opening reading frames）扫描）扫描nORF：每个编码蛋白的基因都含有：每个编码蛋白的基因都含有ORF，它是由一系，它是由一系列密码子组成，通常以列密码子组成，通常以ATG开始，开始，TAA、、TGA、、TAG结束通过寻找起始密码子和终止密码子的结束通过寻找起始密码子和终止密码子的ORF序列是寻找基因的一种重要的方法序列是寻找基因的一种重要的方法n寻找寻找ORF的成功的关键在于的成功的关键在于终止子终止子在在DNA序列中出现序列中出现的频率的频率6中英联合实验室中英联合实验室5.1 在基因组中搜寻基因在基因组中搜寻基因CG含量含量<50%=50%>50%终止子出现终止子出现的频率的频率<64bp即可出即可出现一次现一次64bp出现一出现一次次>64bp才可才可能出现一能出现一次次终止子出现的频率与终止子出现的频率与CG含量之间的关系含量之间的关系7中英联合实验室中英联合实验室5.1 在基因组中搜寻基因在基因组中搜寻基因高等真核生物高等真核生物DNA的的ORF的阅读障碍：的阅读障碍：n基因间存在大量基因间存在大量非编码序列非编码序列（人类基因组（人类基因组占占70%））n很多基因含有很多基因含有内含子内含子n由于多数外显子长度由于多数外显子长度<100个密码子，当读个密码子，当读码进入到内含子时很快就遇到终止密码，码进入到内含子时很快就遇到终止密码，从而难以判断读码的准确性从而难以判断读码的准确性8中英联合实验室中英联合实验室A 起始密码子起始密码子 ATG第一个第一个ATGATG的确定的确定( (依据依据KozakKozak规则规则) )KozakKozak规则是基于已知数据的统计结果规则是基于已知数据的统计结果所谓所谓KozakKozak规则，即第一个规则，即第一个ATGATG侧翼侧翼序列的序列的碱基碱基分布分布所满足的统计规律所满足的统计规律根据开放读码框根据开放读码框(ORF)预测基因预测基因9中英联合实验室中英联合实验室Kozak规则规则:若将第一个若将第一个ATG中的碱基中的碱基A，，T，，G分别标为分别标为1, 2 , 3位，位，侧翼碱侧翼碱基基序列具有以下特征序列具有以下特征：：n第第4位的偏好碱基为位的偏好碱基为GnATG的的5’端约端约15bp范围的侧翼序列内不含碱基范围的侧翼序列内不含碱基Tn在在-3，，-6和和-9位置，位置，G是偏好碱基是偏好碱基n除除-3，，-6和和-9位，在整个侧翼序列区，位，在整个侧翼序列区，C是偏好碱基是偏好碱基10中英联合实验室中英联合实验室B 信号肽分析信号肽分析n信号肽信号肽分析软件分析软件(SignalP) n把预测过程中证实含完整把预测过程中证实含完整mRNA 5’端的序列翻端的序列翻译为蛋白序列译为蛋白序列n然后用然后用SignalP软件对前软件对前50个氨基酸序列个氨基酸序列(从第从第一个一个ATG对应的甲硫氨酸对应的甲硫氨酸Met开始开始)进行评估，进行评估，如果如果SignalP分析给出正面结果，则测试序列有分析给出正面结果，则测试序列有可能为信号肽可能为信号肽 11中英联合实验室中英联合实验室C 终止密码子终止密码子n终止密码子终止密码子: TAA, TAG,TGAn GC% = 50%  终止密码子每终止密码子每 64 bp出现一次出现一次n GC% > 50%  终止密码子每终止密码子每100－－200 bp 出现一次出现一次n 由于多数基因由于多数基因 ORF 均多于均多于50个密码子，因此最可个密码子，因此最可能的选择应该是能的选择应该是 ORF 不少于不少于100 个密码子个密码子12中英联合实验室中英联合实验室D  3’端的确认端的确认 3’端的确认主要根据端的确认主要根据Poly(A)尾序列，若测尾序列，若测试试DNA片段不含片段不含Poly(A)序列，则根据加尾信序列，则根据加尾信号序列号序列“AATAAA”和和BLAST同源性比较结果同源性比较结果共同判断共同判断13中英联合实验室中英联合实验室E 非编码序列、内含子非编码序列、内含子 高等真核生物多数外显子长度少于高等真核生物多数外显子长度少于100 个密码子，有的不到个密码子，有的不到50个密码子甚个密码子甚至更少至更少14中英联合实验室中英联合实验室F 密码子偏爱性密码子偏爱性n编码同一氨基酸的不同密码子称为同义密码，编码同一氨基酸的不同密码子称为同义密码，其差别仅在密码子的第其差别仅在密码子的第3位碱基不同位碱基不同n不同种属间使用同义密码的频率有很大差异，不同种属间使用同义密码的频率有很大差异，如人类基因中，丙氨酸（如人类基因中，丙氨酸（Ale）密码子多为）密码子多为GCA,GCC或或GCT,而而GCG很少使用很少使用15中英联合实验室中英联合实验室G 外显子－内含子边界外显子－内含子边界n外显子和内含子的边界有一些明显的特征外显子和内含子的边界有一些明显的特征n如：内含子的如：内含子的5‘端或称供体位（端或称供体位（donor site））常见的顺序为常见的顺序为 5’ -AG↓GTTAAGT-3’n3’端又称受体位（端又称受体位（acceptor site)，多为，多为5‘PyPyPyPyPyPyCAG-3’ (Py：嘧啶核苷酸，：嘧啶核苷酸，T或或C)16中英联合实验室中英联合实验室 H 上游调控序列上游调控序列n几乎所有基因（或操纵子）上游都有几乎所有基因（或操纵子）上游都有调控调控序列，序列，它们与它们与DNA结合蛋白作用，控制基因表达结合蛋白作用，控制基因表达n通过通过同源性同源性比较来预测比较来预测mRNA的的5’端，最常用的端，最常用的与与转录起始位点转录起始位点相关的数据库是真核相关的数据库是真核启动子启动子数据数据库库(The TRADAT Project , Eukaryotic  Promoter Database, EPD.  )n另外个别生物基因组的另外个别生物基因组的特有组成特有组成也可作为判别依也可作为判别依据，如脊椎动物基因组许多基因的上游都有据，如脊椎动物基因组许多基因的上游都有CpG岛岛     17中英联合实验室中英联合实验室I  软件预测软件预测采用采用NCBI的的ORF预测软件预测软件 ( ORF finder:  )判断判断ORF的可能范围的可能范围18中英联合实验室中英联合实验室5.1 在基因组中搜寻基因在基因组中搜寻基因n适用于高等真核生物基因组的适用于高等真核生物基因组的ORF扫描方法：扫描方法：n上游调控序列（上游调控序列（upstream control sequence）：）：上游调控序列和外显子上游调控序列和外显子-内含子边界一样具有显著内含子边界一样具有显著特征，这些特征是参与基因表达的特征，这些特征是参与基因表达的DNA结合蛋白结合蛋白的识别信号。

但真核的变化也较大的识别信号但真核的变化也较大n同源查询同源查询（（homology search）：利用已存入数）：利用已存入数据库中的基因序列与待查基因组序列进行比较，据库中的基因序列与待查基因组序列进行比较，从中查找可与之匹配的碱基顺序及其比例用于界从中查找可与之匹配的碱基顺序及其比例用于界定基因的方法定基因的方法n孤独基因孤独基因（（orphan gene）：指在基因分类时缺少）：指在基因分类时缺少同源顺序的同源顺序的ORF19中英联合实验室中英联合实验室5.1 在基因组中搜寻基因在基因组中搜寻基因n实验分析确认基因实验分析确认基因分子杂交分子杂交可确定可确定DNA片段是否含有表达顺序片段是否含有表达顺序uNorthern blot：指将待测：指将待测DNA样品标记后与样品标记后与RNA杂杂交，以判断交，以判断RNA中是否含有中是否含有DNA的转录产物但在的转录产物但在操作中存在一些问题操作中存在一些问题uZoo blot：一些亲缘关系相近的物种，其：一些亲缘关系相近的物种，其基因的编基因的编码区码区相似性较高，而非编码区的同源性很低则可相似性较高，而非编码区的同源性很低则可以某一物种的以某一物种的DNA序列与来自另一亲缘种的序列与来自另一亲缘种的DNA片片段杂交，如产生阳性信号，则该区段可能含有段杂交，如产生阳性信号，则该区段可能含有1或多或多个基因个基因20中英联合实验室中英联合实验室问题问题解决方案解决方案某一基因的转录产物进行可变剪接某一基因的转录产物进行可变剪接或该基因为某一多基因家族的成员或该基因为某一多基因家族的成员时，会出现多个杂交带时，会出现多个杂交带设计其他实验区分设计其他实验区分基因的表达具有组织特异性及发育基因的表达具有组织特异性及发育阶段的差别，而选择的阶段的差别，而选择的RNA样品中样品中不一定含有该基因产物不一定含有该基因产物尽可能多地收集各种不同发尽可能多地收集各种不同发育时期及不同组织器官的育时期及不同组织器官的RNA某些基因产物丰度极低或不易提取某些基因产物丰度极低或不易提取适当适当提高提高RNA上样量上样量，或先，或先以已知的以已知的DNA序列序列设计引物设计引物从从mRNA中中扩增扩增基因产物基因产物21中英联合实验室中英联合实验室5.1 在基因组中搜寻基因在基因组中搜寻基因nDNA顺序中基因位置的确定顺序中基因位置的确定uNorthern blot和和Zoo blot可以判断可以判断DNA片段中是否片段中是否含有基因，但是不能给出基因定位信息。

获得基含有基因，但是不能给出基因定位信息获得基因定位信息的最容易的方法是因定位信息的最容易的方法是cDNA测序测序ncDNA测序受两个方面的影响：测序受两个方面的影响：u一是相关一是相关cDNA在在cDNA文库中出现的频率；文库中出现的频率；u二是二是cDNA的完整性的完整性22中英联合实验室中英联合实验室5.1 在基因组中搜寻基因在基因组中搜寻基因n如何获取基因全长如何获取基因全长cDNAcDNA序列序列 ？确定其在基？确定其在基因组中的位置？因组中的位置？nA cDNA A cDNA 文库构建文库构建nB RACE B RACE 技术技术nC C 通过对全长通过对全长cDNAcDNA序列的测序、对比，以及与序列的测序、对比，以及与基基因组因组DNADNA的比较的比较，确定基因所在的区域；通过物，确定基因所在的区域；通过物种已建立种已建立遗传图遗传图和和物理图物理图来确定基因的位置；来确定基因的位置；23中英联合实验室中英联合实验室cDNA文库构建(CLONTECH)24中英联合实验室中英联合实验室cDNA文库构建25中英联合实验室中英联合实验室5’RACE(CLONTECH)26中英联合实验室中英联合实验室3’RACE(CLONTECH)27中英联合实验室中英联合实验室一一. 利用计算机分析基因功能利用计算机分析基因功能二二. 实验分析确定基因功能实验分析确定基因功能三三. 其他的基因功能研究方法其他的基因功能研究方法四四. 主要技术及原理方法主要技术及原理方法5.2 基因功能的测定基因功能的测定28中英联合实验室中英联合实验室一一.利用计算机分析基因功能利用计算机分析基因功能1.1.同源性确定基因功能同源性确定基因功能2.2.同源性分析在酵母基因组计划中的应用同源性分析在酵母基因组计划中的应用5.2 基因功能的测定基因功能的测定29中英联合实验室中英联合实验室1.1.同源性确定基因功能同源性确定基因功能n 同源基因都拥有一个共同的祖先基因，它们之间同源基因都拥有一个共同的祖先基因，它们之间有许多相似的序列。

同源基因可以分为有许多相似的序列同源基因可以分为2类：类：u  种间同源种间同源基因或基因或直系基因直系基因（（orthologous gene）：）：指不同物种之间的同源基因，它们来自物种分化以指不同物种之间的同源基因，它们来自物种分化以前的共同祖先前的共同祖先u   种内同源种内同源基因或基因或平行平行基因（基因（paralogous gene）） 同一物种内的同源基因，它们常常是多基因家族的同一物种内的同源基因，它们常常是多基因家族的不同成员，其共同祖先可能存在于物种形成以后，不同成员，其共同祖先可能存在于物种形成以后，也可能存在于物种形成之前也可能存在于物种形成之前30中英联合实验室中英联合实验室同源基因一般不会有同源基因一般不会有完全一致完全一致的核苷酸序列，因为的核苷酸序列，因为不同的基因或不同的生物都会独立地发生随机突变，不同的基因或不同的生物都会独立地发生随机突变，但它们有相似的序列，大部分未突变的核苷酸但它们有相似的序列，大部分未突变的核苷酸位置位置是是相同相同的的         当一个新基因的序列被确认后，根据同源性可以当一个新基因的序列被确认后，根据同源性可以从数据库中查找已知序列的同源基因。

根据进化的相从数据库中查找已知序列的同源基因根据进化的相关性，可以根据已知的同源基因推测关性，可以根据已知的同源基因推测新基因的功能新基因的功能         同源性分析可以给出整个基因或其中某一区段功同源性分析可以给出整个基因或其中某一区段功能的有关能的有关信息信息31中英联合实验室中英联合实验室2.2.同源性分析在酵母基因组计划中的应用同源性分析在酵母基因组计划中的应用n酵母基因组大约含有酵母基因组大约含有6000个基因，个基因，n30％是通过传统遗传学分析得到的，％是通过传统遗传学分析得到的，n另外另外70％是用同源性分析获得％是用同源性分析获得32中英联合实验室中英联合实验室二二. 实验分析确定基因功能实验分析确定基因功能1. 1. 基因基因失活失活在基因功能分析的作用在基因功能分析的作用2. 2. 基因的基因的超表达超表达用于功能检测用于功能检测5.2 基因功能的测定基因功能的测定33中英联合实验室中英联合实验室n基因的功能是一个过程，是从基因到表型的一系列基因的功能是一个过程，是从基因到表型的一系列生理生化反应过程现在的基因功能研究与传统的生理生化反应过程现在的基因功能研究与传统的遗传分析正好相反，传统的遗传分析是从遗传分析正好相反，传统的遗传分析是从表型表型出发出发最终到达最终到达基因基因（（正向遗传学正向遗传学），而在基因组计划中），而在基因组计划中研究基因功能则是从基因出发，最终到达表型（研究基因功能则是从基因出发，最终到达表型（反反向遗传学向遗传学）。

因此必须寻找一系列的实验方法来鉴）因此必须寻找一系列的实验方法来鉴别与目标基因相关的表型别与目标基因相关的表型n基因失活基因失活是基因功能分析的主要手段是基因功能分析的主要手段1.1.基因失活基因失活在基因功能分析的作用在基因功能分析的作用34中英联合实验室中英联合实验室n基因失活基因失活u基因剔除（基因剔除（knock-out））u反义反义RNA技术技术u转座子插入突变转座子插入突变35中英联合实验室中英联合实验室5.2 基因功能的测定基因功能的测定n基因剔除（基因剔除（knock-out））   最简单的基因失活方法，将一段无关的最简单的基因失活方法，将一段无关的DNA片片段用来取代目标基因段用来取代目标基因u主要原理：用一段主要原理：用一段无关无关的核苷酸序列的核苷酸序列取代取代目标基因目标基因的的中间中间序列，并将其导入生物体内或目的细胞内，序列，并将其导入生物体内或目的细胞内，如果该基因所控制的表型变化了，就从反面验证了如果该基因所控制的表型变化了，就从反面验证了目标基因的功能目标基因的功能36中英联合实验室中英联合实验室n反义反义RNA技术技术       反义反义RNA由基因的负链（模板链的互补链）由基因的负链（模板链的互补链）编码，可以与由功能基因转录而成的正义编码，可以与由功能基因转录而成的正义RNA形形成双链结构，成双链结构，干扰干扰mRNA的翻译，从而干扰基因的翻译，从而干扰基因的表达的表达n      将基因的将基因的编码序列反向编码序列反向插入表达载体，插入表达载体，转化转化目目标生物，获得转基因个体或品系后，进一步分析标生物，获得转基因个体或品系后，进一步分析表达的反义表达的反义RNA在生理生化或形态发生中所起的在生理生化或形态发生中所起的作用，由此判别目标基因的功能作用，由此判别目标基因的功能n转座子插入突变转座子插入突变    将转座子随机插入功能基因内，使其失活，也将转座子随机插入功能基因内，使其失活，也可以用于基因功能研究。

可以用于基因功能研究 37中英联合实验室中英联合实验室2. 2. 基因的超表达用于功能检测基因的超表达用于功能检测 在正常情况下，基因产物的数量是有限制的，在正常情况下，基因产物的数量是有限制的，必须与其它基因的产物必须与其它基因的产物平衡平衡，某一基因产物的过，某一基因产物的过量和不足都会破坏这种平衡，造成生长和发育的量和不足都会破坏这种平衡，造成生长和发育的异常异常       有两种技术可以使细胞中某一基因过量表达：有两种技术可以使细胞中某一基因过量表达：           增加基因的增加基因的拷贝数拷贝数；；           采用采用强启动子强启动子38中英联合实验室中英联合实验室5.2 基因功能的测定基因功能的测定n许多蛋白质必须与其他蛋白质互作，才能表现其许多蛋白质必须与其他蛋白质互作，才能表现其功能，当鉴定了这类蛋白质的某些成员，则可采功能，当鉴定了这类蛋白质的某些成员，则可采用某些方法分离与之互作的其他蛋白质用某些方法分离与之互作的其他蛋白质u噬菌体展示噬菌体展示 （（phage display））u酵母双杂交（酵母双杂交（yeast two-hybridization））三三.  其他的基因功能研究方法其他的基因功能研究方法39中英联合实验室中英联合实验室5.2 基因功能的测定基因功能的测定n噬菌体展示噬菌体展示n检测的基因与噬菌体外壳蛋白基因融合，表达后检测的基因与噬菌体外壳蛋白基因融合，表达后可产生可产生融合外壳蛋白融合外壳蛋白，当噬菌体遇到可与融合外，当噬菌体遇到可与融合外壳蛋白壳蛋白互作的蛋白质互作的蛋白质时会发生时会发生聚合聚合40中英联合实验室中英联合实验室5.2 基因功能的测定基因功能的测定酵母菌双杂交系统酵母菌双杂交系统 真核生物中，转录因子与基因上游的特定真核生物中，转录因子与基因上游的特定DNA序列结合，然后激活序列结合，然后激活RNA聚合酶，起始聚合酶，起始RNA的合成。

的合成 转录因子有转录因子有2个重要的功能区域，一个与个重要的功能区域，一个与启动启动子子区域的区域的DNA序列结合，另一个与序列结合，另一个与RNA聚合酶聚合酶的的激活有关有些转录因子中的激活有关有些转录因子中的这这2个片段即使分割个片段即使分割开来，仍然可以在开来，仍然可以在同一个细胞内相互作用，同一个细胞内相互作用，装配装配成一个完整的、有功能的转录因子成一个完整的、有功能的转录因子  41中英联合实验室中英联合实验室酵母菌双杂交系统中，将编码这酵母菌双杂交系统中，将编码这2个功能域的个功能域的DNA分分别构建在别构建在2个独立的表达载体上个独立的表达载体上在一个表达载体中，在一个表达载体中，DNA结合功能域结合功能域的基因片段与的基因片段与待待测蛋白质测蛋白质的基因连接成融合基因的基因连接成融合基因在另一个载体中，在另一个载体中，RNA聚合酶激活功能域聚合酶激活功能域的基因片段的基因片段与与未知的未知的DNA序列序列连接成融合蛋白基因连接成融合蛋白基因将这将这2个表达载体同时转化一个细胞，并在细胞内表个表达载体同时转化一个细胞，并在细胞内表达，如果达，如果DNA结合功能域蛋白与同结合功能域蛋白与同RNA聚合酶激聚合酶激活功能域蛋白之间能够互作，就会启动报告基因的活功能域蛋白之间能够互作，就会启动报告基因的表达。

表达42中英联合实验室中英联合实验室四四 主要技术及原理方法主要技术及原理方法4.1 4.1 基因剔除基因剔除(knock-out)(knock-out) 最简便的基因失活的方法最简便的基因失活的方法. . 主要原理主要原理: : 在一段无关在一段无关DNA DNA 片段的两侧连接与代换基因片段的两侧连接与代换基因两侧相同的顺序两侧相同的顺序, ,将这一构建导入目的细胞将这一构建导入目的细胞, ,由于由于同同源源片段之间的片段之间的重组重组, ,可使无关片段取代靶基因可使无关片段取代靶基因, ,整合整合到染色体中到染色体中. .为了便于筛选为了便于筛选, ,用于取代的外源用于取代的外源DNADNA中中含有报告基因含有报告基因. . 43中英联合实验室中英联合实验室tk 胸苷激酶标记基因 ← gangcyclovirneor 新霉素抗性基因→G41844中英联合实验室中英联合实验室45中英联合实验室中英联合实验室4.2 4.2 基因超表达基因超表达 通过增加基因的通过增加基因的拷贝拷贝数数和采用和采用强启动子强启动子促使基促使基因因超表达超表达，致使受体表现，致使受体表现出生长与发育的异常出生长与发育的异常, ,来研来研究基因的功能究基因的功能. .46中英联合实验室中英联合实验室 4.3 4.3 反义反义RNARNA 反义反义RNARNA是由基因的负链编码是由基因的负链编码, ,可与正义可与正义RNA RNA (sense RNA)(sense RNA)或或DNA DNA 编码顺序结合编码顺序结合, ,干扰干扰mRNA mRNA 的的转录转录, ,加工和转运加工和转运, ,调控基因的表达调控基因的表达. .47中英联合实验室中英联合实验室n构建反义构建反义RNA RNA 表达载体表达载体: : 将全目的基因或部分目的基因反向插入表达载将全目的基因或部分目的基因反向插入表达载体体 → → 转化目标生物转化目标生物 → →获得转基因个体或品系获得转基因个体或品系 → → 分析转基因植株在生理、生化、形态等方面分析转基因植株在生理、生化、形态等方面的变异的变异 → → 判别目的基因的功能判别目的基因的功能48中英联合实验室中英联合实验室正义表达载体正义表达载体反义表达载体反义表达载体49中英联合实验室中英联合实验室n反义反义RNA RNA 作用机理：作用机理： A A 干扰翻译的起始与延伸干扰翻译的起始与延伸，可与翻译起始顺序，可与翻译起始顺序及编码序列结合形成双链及编码序列结合形成双链RNARNA，随之被细胞降解。

随之被细胞降解 B B 与与mRNA mRNA 的引导顺序结合，阻止核糖体的附着，的引导顺序结合，阻止核糖体的附着，使使翻译无法启动翻译无法启动 C C 反义反义RNARNA与与mRNAmRNA形成双链分子后，使形成双链分子后，使RNARNA多聚多聚酶脱离模板酶脱离模板, ,转录终止转录终止50中英联合实验室中英联合实验室4.4 RNAi干扰 RNAiRNAi干扰是通干扰是通过双链过双链RNARNA的介导的介导, ,特异性地降解相应序列的特异性地降解相应序列的mRNA,mRNA,从而从而阻断相应基因表达的转录后水平的阻断相应基因表达的转录后水平的基因沉默基因沉默机制机制. .51中英联合实验室中英联合实验室RNAi RNAi 作用机理作用机理A dsRNAA dsRNA核酸内切酶核酸内切酶DicerDicer被激活被激活, ,它把它把dsRNAdsRNA加工成加工成21-2521-25个核苷酸长的个核苷酸长的RNARNA链链; ;B B 这些小片段这些小片段RNA(RNA(siRNAsiRNA) )作为另一个核糖作为另一个核糖核酸复合体核酸复合体RISCRISC(RNA-induce (RNA-induce silencing complex,RNAsilencing complex,RNA诱导沉默复合诱导沉默复合体体) )的指引物的指引物, ,结合到结合到RISCRISC上上, ,使之识别使之识别并降解并降解mRNA,mRNA,从而导致与从而导致与双链双链RNARNA同源同源的的基因沉默基因沉默; ;52中英联合实验室中英联合实验室53中英联合实验室中英联合实验室nRNAiRNAi设计方法及应用设计方法及应用A FraserFraser 合成合成与开放读码框相对应的双链与开放读码框相对应的双链RNARNA或利用或利用细菌克隆表达细菌克隆表达这些双链这些双链RNA→RNA→微微量注射量注射/ /喂食喂食→→干扰同源基因的表达干扰同源基因的表达B Chuang B Chuang 等设计出嵌合体结构等设计出嵌合体结构 → → 连接强连接强启动子大量表达双链启动子大量表达双链mRNA→mRNA→干扰同源基因干扰同源基因的表达的表达54中英联合实验室中英联合实验室HbF基因的基因的RNAi载体构建载体构建55中英联合实验室中英联合实验室RNAiRNAi技术的优缺点技术的优缺点nRNAiRNAi最根本的特点是特异性最根本的特点是特异性nRNAiRNAi具有特殊的具有特殊的穿越能力穿越能力, ,如将双链如将双链RNARNA注射虫注射虫性腺性腺里里, ,它也会干扰到它也会干扰到体细胞体细胞里的基因表达里的基因表达, ,而且干而且干扰作用会扰作用会传给后代传给后代; ;n对一些低水平表达的基因，对一些低水平表达的基因，RNAiRNAi现象并不明显现象并不明显nRNAiRNAi能同时作用于几个有相同或相似序列的基因能同时作用于几个有相同或相似序列的基因56中英联合实验室中英联合实验室4.5 4.5 酵母双杂交（酵母双杂交（yeast two-yeast two-hybridizationhybridization））n原理：原理： 其原理涉及转录因子与启动子之间的互作。

转录因其原理涉及转录因子与启动子之间的互作转录因子子 （包括两个功能区域）（包括两个功能区域）→→ 结合功能域结合功能域同基因上同基因上游的区段结合游的区段结合 →→ 激活功能域激活功能域激活激活RNARNA多聚酶多聚酶 → → 将基因转录为将基因转录为mRNA mRNA 57中英联合实验室中英联合实验室n酵母杂交系统中：酵母杂交系统中： 融合表达载体融合表达载体1 融合表达载体融合表达载体2DNA结合功能域结合功能域+目的片段目的片段激活功能域激活功能域+ 多种未知多种未知cDNA 融合表达载体融合表达载体1同一细胞同一细胞 融合表达载体融合表达载体2 形成聚合物，启动形成聚合物，启动报告基因的表达报告基因的表达表达载体共转化表达载体共转化58中英联合实验室中英联合实验室59中英联合实验室中英联合实验室5.3 从基因组到细胞从基因组到细胞n转录本组转录本组transcriptomeuDNA芯片分析芯片分析uSAGEn蛋白质组蛋白质组proteome60中英联合实验室中英联合实验室uDNA芯片分析芯片分析«芯片表面原位直接合成寡聚核苷酸芯片表面原位直接合成寡聚核苷酸, 一一百万个寡聚核苷酸百万个寡聚核苷酸/cm2«荧光标记样品荧光标记样品cDNA，杂交，扫描，根，杂交，扫描，根据杂交位置确定序列据杂交位置确定序列« 一次实验可同时检测成千上万个基因一次实验可同时检测成千上万个基因的表达谱，可提供大量有关基因相互作的表达谱，可提供大量有关基因相互作用的信息用的信息61中英联合实验室中英联合实验室uSAGE：：基因表达系列分析基因表达系列分析«转录物内特定位置的一小段寡核苷酸转录物内特定位置的一小段寡核苷酸序列，序列， 含有鉴定一个转录物特异性的含有鉴定一个转录物特异性的足够信息，作为区别转录物的标签足够信息，作为区别转录物的标签«标签串联在一起，形成大量多联体，标签串联在一起，形成大量多联体，克隆测序，用克隆测序，用SAGE软件分析软件分析«确定表达基因种类，并根据标签出现确定表达基因种类，并根据标签出现的频率确定基因的表达丰度的频率确定基因的表达丰度62中英联合实验室中英联合实验室n蛋白质组蛋白质组proteomeu分析全部蛋白质组所有成分、数量，确分析全部蛋白质组所有成分、数量，确定各种组分所在的空间位置、修饰方法、定各种组分所在的空间位置、修饰方法、互作机制、生物活性和特定功能。

互作机制、生物活性和特定功能u目前还缺乏比较理想的技术来分析细胞目前还缺乏比较理想的技术来分析细胞中整个蛋白质组分中整个蛋白质组分u双向电泳分离蛋白质或多肽，随后再测双向电泳分离蛋白质或多肽，随后再测定每个电泳斑点蛋白质或多肽的氨基酸定每个电泳斑点蛋白质或多肽的氨基酸63中英联合实验室中英联合实验室n蛋白质组分析的复杂性蛋白质组分析的复杂性u许多加工方式，如磷酸化、糖基化、乙酰基化、泛许多加工方式，如磷酸化、糖基化、乙酰基化、泛素化、法尼基化、二硫键素化、法尼基化、二硫键u 1个基因可编码许多不同的蛋白质，表现为组织特个基因可编码许多不同的蛋白质，表现为组织特异性异性u蛋白质之间存在大量的相互作用，如形成同源或异蛋白质之间存在大量的相互作用，如形成同源或异源二聚体、三聚体、多聚体，不同的结合状态有不源二聚体、三聚体、多聚体，不同的结合状态有不同的活性；同的活性；u1 种蛋白质可参与多种反应，或多种蛋白质参与种蛋白质可参与多种反应，或多种蛋白质参与1种反应64中英联合实验室中英联合实验室n虫中鉴定了虫中鉴定了29个与发育有关的蛋白质个与发育有关的蛋白质n借助已有的基因组序列扩大蛋白质功能的搜寻范围，寻找借助已有的基因组序列扩大蛋白质功能的搜寻范围，寻找所有不同基因组中同时出现或同时丢失的蛋白质成员，它所有不同基因组中同时出现或同时丢失的蛋白质成员，它们表现出们表现出协同进化协同进化n多肽功能域多肽功能域n紧密紧密连锁基因连锁基因，组成独立的进化单位。

尽管它们的表达调，组成独立的进化单位尽管它们的表达调控相互独立，但在功能上彼此相关控相互独立，但在功能上彼此相关n参与同一细胞事件（细胞分裂与凋亡）的基因表现为参与同一细胞事件（细胞分裂与凋亡）的基因表现为共调共调节节n搜集生理生化过程及特定细胞事件（癌变中）上调或下调搜集生理生化过程及特定细胞事件（癌变中）上调或下调的的mRNAn利用利用蛋白质微阵技术蛋白质微阵技术查找互作蛋白、小分子多肽和配位体查找互作蛋白、小分子多肽和配位体结合的蛋白质结合的蛋白质65中英联合实验室中英联合实验室66。