《大肠杆菌基因组DNA的提取及荧光定量PCR试验设计》.docx

大肠杆菌基因组DNA的提取一、传统法提取大肠杆菌基因组DNA1、实验原理提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含十二烷基硫酸钠（SDS）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出SDS的作用机理是由于其能结合蛋白，中和蛋白的电性，使蛋白质的非共价键受到破坏，失去二级结构，从而变形失活，蛋白酶K或链霉蛋白酶E均为光谱蛋白酶，其重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在的情况下保持很高的活性在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可通过失活蛋白破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白和DNA分离；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来用酚、酚/氯仿抽提除去蛋白质，最后用无水乙醇沉淀DNA为获得高纯度DNA，操作过程中常加入RNaseA除去RNACTAB（十六烷基三乙基溴化铵）是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7 mol/L NaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定的程度（0.3 mol/L NaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白，多糖物质分开。

最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去2、实验试剂与仪器1）实验材料：大肠杆菌2）实验试剂：LB液体培养基，TE溶液，10%SDS，蛋白酶K，5mol/L NaCl， CTAB/NaCl溶液，酚/氯仿/异戊醇，异丙醇，70%乙醇3）实验仪器：恒温摇床、低温离心机、微量移液器、水浴锅3、溶液配制1）LB液体培养基：细菌培养用胶化蛋白胨10 g/L，细菌培养用酵母提取物5 g/L，NaCl 10g/L，去离子水 (搅拌溶解后，用5mol/LNaOH调pH至7.0.用去离子水定容100ml，用20/50ml摇瓶分装5瓶，包扎好，在121℃，1.034×105 pa高压下蒸汽灭菌20min.)2）TE缓冲液：1M Tris 溶液（取Tris242.2g，加ddH2O至1600ml，加热溶解）1M tris-HCl pH8.0 溶液（取 1M Tris 溶液160ml用分析纯盐酸调至Ph=8.0（需浓盐酸约8.5ml），加ddH2O定容至200ml，高压灭菌备用） TE缓冲液（10 mM Tris-HCl 1Mm EDTA pH=8.0，1M Tris-HCl Buffer PH=8.0 5ml0.5M EDTA PH =8.0 1ml向烧杯中加入约400mldd H2O均匀混合;将溶液定容到500ml后，高温高压灭菌，室温保存）3）蛋白酶K：（20mg蛋白酶K溶于1ml无菌双蒸水，-20℃备用）4）CTAB/NaCl溶液：（5% w/v，5gCTAB溶于100ml 0.5M NaCl溶液中，需加热到65℃使之溶解，然后室温保存） 4、实验方法步骤1、将大肠杆菌接种到灭菌好的LB培养基中，一级培养过夜，以10%的接种量进行二级培养，培养至对数期（4-6h）。

2、取菌液1.5ml置于离心管中，以5000rpm冷冻离心1min，弃上清液3、加190 ul TE悬浮沉淀，并加10 ul 10%SDS,摇匀直至溶液变粘稠4、加入1ul蛋白酶K（20mg/ml），混匀，37℃保温1小时5、加30ul 5 mol/L NaCl,混匀6、加30ul CTAB/NaCl溶液，混匀，65℃保温20min7、加入300ul酚/氯仿/异戊醇抽提（25：24:1），5000rmp离心10min8、取上清液，加入300ul氯仿/异戊醇（24:1）抽提，5000rmp离心10min9、取上清液，加入300ul的异丙醇，颠倒混匀，室温下静止10min，沉淀DNA，5000rmp离心10min10、加500ul 70%乙醇洗沉淀，5000rmp离心10min11、弃上清液，待酒精挥发尽后加30ulTE溶解12、溶解于20ul TE中，-20℃保存二、试剂盒法提取大肠杆菌基因组DNA细菌基因组DNA提取试剂盒：1、TGuide细菌基因组DNA提取试剂盒DP302-02 50次 420元2、TaKaRa细菌基因组DNA小量纯化试剂盒TaKaRa  DV810A 50 650元3、Biomiga 细菌基因组DNA提取试剂盒GD2411-01 Bacterial gDNA kit 50次 423元GD2411-02 Bacterial gDNA kit 250次 1798元4、Biospin 细菌基因组 DNA 提取试剂盒BSC12S1 50次 400元 BSC12M1 100次 750元5、OMEGA细菌基因组DNA提取试剂盒D3350-00 E.Z.N.A.TM Bacterial DNA kit 5 210元D3350-01 E.Z.N.A.TM Bacterial DNA kit 50 980 元D3350-02 E.Z.N.A.TM Bacterial DNA kit 200 3350元荧光定量PCR试验（标准曲线法）定量实验是一种实时实验，用于在聚合酶链反应 (PCR) 的每个扩增循环期间测定靶核苷酸序列 （靶）数量。

其中靶可以是 DNA、 cDNA 或 RNA实验原理】在实时定量实验中，反应是在 PCR 产物的扩增达到固定荧光水平时的循环期间时间点来描述的，而不是在固定循环次数后累积的 PCR 产物最终数量来描述扩增曲线以图形形式显示在执行的循环次数中检测到的荧光 在 PCR 的最初几次循环中，荧光信号没有明显变化该预定义的 PCR 循环范围称为基线首先，软件通过计算归一化报告荧光信号强度 （与基线循环相对应的 Rn 值）的数学趋势，生成一个基线简化扩增曲线然后，算法将搜索扩增曲线上基线校准后归一化报告荧光信号强度 （ delta Rn [∆Rn] 值）与阈值交叉的点 ∆Rn 值与阈值交叉的分数循环定义为 CT一、试验设计使用StepOne软件中的Design Wizard（设计导向）创建新实验1、定义实验属性在 Experiment Properties （实验属性）屏幕上，输入实验的标识信息，然后选择要设计的实验类型1）Experiment Name （实验名称）2）Barcode （条码），然后输入您的 PCR 反应板上的条码可不填）3）User Name （用户名）4）Comments （注释）。

可不填）5）选择 Quantitation （定量）实验类型6）Next> （下一步）2、定义方法和材料在 Methods & Materials （方法和材料）屏幕上，选择用于实验的定量方法、试剂、升降温速度和 PCR 模板1）将 Standard Curve （标准曲线）选为定量方法将 Standard Curve （标准曲线）选为定量方法 标准曲线实验确定样本中靶序列的绝对量 从已知量的稀释序列中构建的标准曲线用于归档结果 当设置反应板时，标准曲线方法需要靶、标准品和样本用于标准曲线实验的 PCR 反应包括以下组分：• 样本 － 其中靶数量未知的样本• 标准品 － 数量已知的样本• 标准品稀释序列 － 一组用于构建标准曲线的标准品稀释液 （例如，1:2、1:4、 1:8、 1:16、 1:32） • 重复数 － 含有相同组分和量的相同反应数• 阴性对照 － 含有水或缓冲液的样本，不含模板；也称为 “无模板对照(NTC)”阴性对照应不会扩增2）为试剂选择 TaqMan® Reagents （ TaqMan 试剂）（包括两个引物一个探针） –如果使用 TaqMan 试剂以检测扩增并定量样本中靶的数量，则选择TaqMan® Reagents （ TaqMan 试剂） 。

TaqMan 试剂包括两个引物和一个TaqMan® 探针 引物设计用于扩增靶 TaqMan 探针设计用于杂交靶，并在扩增靶时产生荧光信号切记！ Applied Biosystems 不建议将 TAMRATM 染料随 StepOneTM 系统用作荧光报告基团或淬火基团–如果使用 SYBR Green 试剂以检测扩增并定量样本中靶的数量，则选择 SYBR® Green Reagents （ SYBR Green 试剂） SYBR Green 试剂包括两个引物和 SYBR Green 染料 引物设计用于扩增靶 SYBR Green 染料可在结合到双链 DNA 时产生荧光信号 SYBR Green 染料通常是添加到反应的SYBR Green 母液的一部分 如果使用 SYBR Green 染料：选择 Include Melt Curve （包括解链曲线）以执行扩增靶的解链曲线分析将 Standard （标准）选为升降温速度 Applied Biosystems 不提供 SYBRGreen 试剂的 Fast 母液3）为升降温速度选择 Standard (~2 hours to complete a run) （标准 （约两小时完成运行）） 。

– 如果为 PCR 反应使用 Fast 试剂，则选择 Fast (~40 Minutes toComplete a Run) （快速 （约 40 分钟完成运行） ） – 如果为 PCR 反应使用标准试剂 （包括 SYBR Green 试剂和 TaqMan 试剂） ，则选择 Standard (~2 Hours to Complete a Run) （标准 （约 2 小时完成运行）） 4）为模板类型选择 gDNA (genomic DNA) （ gDNA （基因组 DNA） ） 5）Next> （下一步） 3、设置靶在 Targets （靶）屏幕上，输入您想在 PCR 反应板中定量的靶数量，然后为每个靶设置检测1）单击 How many targets do you want to quantify in the reaction plate? （您想在反应板中定量多少靶？）字段，然后输入 1（根据需要填）注意： 靶检测表中的行数将以您输入的数字更新2）选择 Set Up Standards （设置标准品）复选框，以为靶检测设置标准品建议反应板中的每个靶检测设置一条标准曲线注意： Set Up Standards （设置标准品）复选框默认情况下已选取。

3）设置靶 1 检测：a. 单击 Enter Target Name （输入靶名称）单元格，然后输入 RNase P（示例）b. 从 Reporter （报告基团）下拉菜单中，选择 FAM （默认） – 如果要将 FAMTM 染料加在您用于检测靶的 TaqMan 探针的 5′ 端，则选择FAM– 如果要将 JOETM 染料加在您用于检测靶的 TaqMan 探针的 5′ 端，则选择JOE– 如果要将 VIC® 染料加在您用于检测靶的 TaqMan 探针的 5′ 端，则选择VIC– 如果您正使用 SYBR® Green 染料以检测双链 DNA，则选择 SYBRc. 从 Quencher （淬火基团）下拉菜单中，选择 NFQ-MGB （默认） – 如果要将非荧光淬火基团－小沟结合物加在您正用于检测靶的 TaqMan 探针的 3′ 端，则选择 NFQ-MGB– 如果您正使用 SYBR Green 染料，则选择 None （无） 4）Next> （下一步） 。