药物分析第十五章甾体激素类药物的分析.ppt

Binzhou Medical UniversityBinzhou Medical University药物分析教研室药物分析教研室主讲人：于晨主讲人：于晨第十章第十章 甾体激素类药物的分析甾体激素类药物的分析Analysis of steroid hormones 激素激素（（HormoneHormone，荷尔蒙），荷尔蒙） 是人体内各种内分泌腺所分泌的一种生是人体内各种内分泌腺所分泌的一种生物活性物质激素作用于特定的称为物活性物质激素作用于特定的称为靶器官靶器官的组织、细胞上而发挥作用如果激素分泌的组织、细胞上而发挥作用如果激素分泌出现平衡失调，可使人体发生病变，如甲亢、出现平衡失调，可使人体发生病变，如甲亢、糖尿病等糖尿病等 概概 述述甾体激素类甾体激素类药物均具有药物均具有环戊烷骈多环戊烷骈多氢菲氢菲母核第一节第一节 基本结构与性质基本结构与性质按照按照C C1010,C,C1313,C,C1717取代基取代基不同分类不同分类按药理作用分类按药理作用分类第一节第一节 基本结构与性质基本结构与性质△△4 4–3 3–酮基酮基（紫外吸收）（紫外吸收）天然天然皮质激素皮质激素：：氢化可的松氢化可的松Ø孕甾烷母核有孕甾烷母核有2121个碳原子个碳原子C C1717–醇酮基醇酮基（还原性）（还原性）孕甾烷母核孕甾烷母核第一节第一节 基本结构与性质基本结构与性质311172021氢化可的松(hydrocortisone)醋酸地塞米松(dexamethasone acetate)16α-甲基21-酯化17α-羟基9α-氟3-酮1,2-双键11β-羟基20-酮第一节第一节 基本结构与性质基本结构与性质第一节第一节 基本结构与性质基本结构与性质肾上腺皮上腺皮质激素激素类药物物结构特征构特征ABDC1234第一节第一节 基本结构与性质基本结构与性质第一节第一节 基本结构与性质基本结构与性质第一节第一节 基本结构与性质基本结构与性质第一节第一节 基本结构与性质基本结构与性质甲睾酮(methyltestosterone)丙酸睾酮(testosterone propionate)苯丙酸诺龙(nandrolone phenylpropionate)17β-羟基第一节第一节 基本结构与性质基本结构与性质甲睾酮(methyltestosterone)第一节第一节 基本结构与性质基本结构与性质Ø 孕甾烷孕甾烷母核有母核有2121个碳原个碳原子子Ø 口服被迅速破坏失效，口服被迅速破坏失效，只能肌注只能肌注△△4 4–3 3–酮基酮基第一节第一节 基本结构与性质基本结构与性质黄体酮(progesterone)醋酸甲地孕酮(megestrol acetate )米非司酮(mifepristone)第一节第一节 基本结构与性质基本结构与性质天然的雌性激素：天然的雌性激素：雌二醇雌二醇Ø 雌甾烷雌甾烷母核有母核有1818个碳原个碳原子子Ø A A环为苯环，环为苯环，C C3 3位上有酚位上有酚羟基，羟基，C C1717位上有羟基位上有羟基 结构不稳定，口服无效结构不稳定，口服无效第一节第一节 基本结构与性质基本结构与性质结构修饰结构修饰 炔雌醇炔雌醇 戊酸雌二醇戊酸雌二醇 苯甲酸雌二醇苯甲酸雌二醇乙炔基引入，使乙炔基引入，使仲醇变叔醇，增仲醇变叔醇，增加空间位阻，阻加空间位阻，阻碍酶对药物的氧碍酶对药物的氧化代谢，化代谢，可口服可口服1717位羟基酯化，位羟基酯化，酯在体内缓慢水酯在体内缓慢水解，解，延效延效3 3位羟基酯化，位羟基酯化，酯在体内缓慢酯在体内缓慢水解，水解，延效延效可口服可口服高效高效长效长效人工合成代用品：人工合成代用品：非甾体化合物非甾体化合物己烯雌二酚己烯雌二酚高效、长效高效、长效第一节第一节 基本结构与性质基本结构与性质△△4 4–3 3–酮酮C C1717–αα–醇醇酮基酮基C C1717–ββ–羟羟基基C C1717–甲酮基甲酮基A A环为环为3 3–OHOH苯环苯环肾上腺皮质肾上腺皮质激素激素+ ++ +雄性与蛋白雄性与蛋白同化激素同化激素+ ++ +雌性激素雌性激素+ ++ +孕激素孕激素+ ++ +鉴别反应鉴别反应UVUV、羰基、羰基试剂、氨试剂、氨基脲反应基脲反应还原性（碱还原性（碱性酒石酸酮、性酒石酸酮、氨制氨制AgNOAgNO3 3））可成酯可成酯与亚硝基铁氰与亚硝基铁氰化钠、间二硝化钠、间二硝基苯反应基苯反应UVUV、与重、与重氮苯磺酸氮苯磺酸盐反应盐反应特殊官能团与分析方法特殊官能团与分析方法第二节第二节 理化性质与鉴别试验理化性质与鉴别试验白色至微黄色粉末或结晶性粉末。

白色至微黄色粉末或结晶性粉末三氯甲烷中微溶至易溶；三氯甲烷中微溶至易溶；甲醇或乙醇中微溶甲醇或乙醇中微溶乙醚或植物油极微溶乙醚或植物油极微溶水中不溶水中不溶1. 性状与溶解度性状与溶解度第二节第二节 理化性质与鉴别试验理化性质与鉴别试验2、熔点、熔点一具有鉴定的意义；二则可以反映药物的纯度一具有鉴定的意义；二则可以反映药物的纯度炔诺酮：熔点炔诺酮：熔点202～～208℃3.比旋度比旋度甾体激素多具有手型碳原子，具有旋光性甾体激素多具有手型碳原子，具有旋光性4.吸收系数吸收系数第二节第二节 鉴别试验鉴别试验（一）（一）强强酸的呈色反酸的呈色反应强强酸：酸： H2SO4、、H3PO4、、HClO4、、HCl原理：原理：酮基先基先质子化，形成正碳离子，再与子化，形成正碳离子，再与HSO4-作用呈色作用呈色甾体激素类甾体激素类药物药物硫酸、磷酸、高氯酸、盐酸硫酸、磷酸、高氯酸、盐酸呈色呈色显显 色色荧光荧光加水稀释加水稀释氢化可的松氢化可的松棕黄色至红色棕黄色至红色 绿色绿色黄色至橙黄色黄色至橙黄色炔雌醇炔雌醇橙红橙红黄绿黄绿玫红絮状玫红絮状↓炔雌醚炔雌醚橙红橙红黄绿黄绿红色红色↓泼尼松泼尼松黄黄→橙橙—黄色渐变蓝绿色黄色渐变蓝绿色泼尼松龙泼尼松龙深红深红—灰色絮状灰色絮状↓地塞米松地塞米松淡红棕色淡红棕色—颜色消失颜色消失苯甲酸雌二醇苯甲酸雌二醇黄绿色黄绿色蓝色蓝色淡橙色淡橙色与硫酸显色反应与硫酸显色反应1. C17-α-醇酮基醇酮基——还原性还原性A. 呈色反应呈色反应C17-α-醇酮基醇酮基四氮唑盐四氮唑盐OH-呈色呈色B. 沉淀反应沉淀反应C17-α-醇酮基醇酮基氨制硝酸银氨制硝酸银银镜反应银镜反应C17-α-醇酮基醇酮基碱性酒石酸铜碱性酒石酸铜Cu2O↓（多伦试液）（多伦试液）（斐林试液）（斐林试液）2.C3–酮基和酮基和C20–酮基酮基甾酮类甾酮类2,4-二硝基苯肼二硝基苯肼呈色呈色异烟肼、硫酸苯肼异烟肼、硫酸苯肼异烟腙（黄色）睾酮异烟双腙（黄色）黄体酮成腙反应中成腙反应中Ø C20–酮基受酮基受C18甲基的甲基的空间位阻影响，反应较空间位阻影响，反应较慢，需加热或较长时间慢，需加热或较长时间放置，才完成反应。

放置，才完成反应Ø C3–酮基空间位阻最小，酮基空间位阻最小，最易起反应，室温下生成最易起反应，室温下生成单腙3.3.甲酮基甲酮基或活泼亚甲基或活泼亚甲基蓝紫色黄体酮Ø 适用：具有适用：具有甲酮基甲酮基或或活泼亚甲基活泼亚甲基的甾体激素类药物的甾体激素类药物Ø 能与能与亚硝基铁氰化钠、间二硝基酚、芳香醛亚硝基铁氰化钠、间二硝基酚、芳香醛反应呈色反应呈色☻黄体酮专属性反应黄体酮专属性反应黄体酮黄体酮其他甾体其他甾体亚硝基铁氰化钠亚硝基铁氰化钠蓝紫色蓝紫色淡橙色或不显色淡橙色或不显色又称为碱性硝普钠反应又称为碱性硝普钠反应碱性碱性甲酮基：甲酮基：有机氟有机氟Fˉ有机破坏有机破坏有机氯有机氯4 4、卤元素的呈色反应、卤元素的呈色反应茜素氟蓝茜素氟蓝—硝酸亚铈硝酸亚铈硝酸硝酸—硝酸银硝酸银呈蓝紫色呈蓝紫色 ClˉAgCl氯原子结合氯原子结合在母核环上在母核环上Ø 适用：雌激素类药物适用：雌激素类药物5.5.酚羟基的呈色反应酚羟基的呈色反应Ø 能与能与重氮苯磺酸重氮苯磺酸发生偶合反应，生成发生偶合反应，生成红色偶氮红色偶氮染料JP利用此反应鉴别苯甲酸雌二醇利用此反应鉴别苯甲酸雌二醇6. 6. 乙炔基乙炔基↓炔雌醇白含炔基的甾体激素，炔诺酮，炔雌醇等含炔基的甾体激素，炔诺酮，炔雌醇等Ø 原理：一些甾体激素类药物具有醋酸酯、戊酸原理：一些甾体激素类药物具有醋酸酯、戊酸酯及已酸酯的结构，可先行水解，根据水解产物酯及已酸酯的结构，可先行水解，根据水解产物来鉴别。

来鉴别7、酯的水解产物的反应、酯的水解产物的反应Ø 适用：适用： 本类药物本类药物C3、、C17或或C21位上羟基的酯位上羟基的酯Ø 结果：结果： 醋酸酯醋酸酯水解后生成的醋酸可与乙醇反应，生成水解后生成的醋酸可与乙醇反应，生成有香气醋酸乙酯有香气醋酸乙酯 戊酸或己酸酯戊酸或己酸酯类水解后可生成有特臭的戊酸或类水解后可生成有特臭的戊酸或己酸，进行鉴别己酸，进行鉴别△△４４-3-酮酮240nm左右左右280nm左右左右苯环苯环其他共轭结构其他共轭结构200-760nm有特征吸收有特征吸收可规定最大吸收波长、可规定最大吸收波长、A、吸收系数、、吸收系数、A大大/A小小原原 理理方方 法法 曲安息曲安息曲安息曲安息龙龙丙酸倍丙酸倍丙酸倍丙酸倍氯氯米松米松米松米松溶溶溶溶剂剂甲醇甲醇甲醇甲醇乙醇乙醇乙醇乙醇浓浓度度度度20μg/ml20μg/ml20μg/ml20μg/ml结结果判断果判断果判断果判断在在在在238nm238nm处处有最大吸收有最大吸收有最大吸收有最大吸收在在在在239nm239nm处处有最大吸收，有最大吸收，有最大吸收，有最大吸收，A A为为 0.570.57～～～～0.600.60，在，在，在，在239nm239nm与与与与263nm 263nm 处处的吸收度比的吸收度比的吸收度比的吸收度比值为值为2.252.25～～～～2.452.45示示 例例结构特征：结构特征： 酚羟基酚羟基 C17 –OH C17 –乙炔基乙炔基例例:炔雌醇炔雌醇1505cm-13505cm-13300cm-1ν1590cm-13610cm-1酚羟基酚羟基醇羟基醇羟基1615cm-1苯环的骨架振动苯环的骨架振动eg2：黄体酮：黄体酮结构特征：结构特征： △ △４４-3--3-酮酮 C C1717- -酮基酮基1700cm-1 C=O20位酮基位酮基1665cm-13位酮基位酮基1615cm-1870cm-1 C-H双键双键TLC法法HPLC应用应用甾体激素类药物原料与甾体激素类药物原料与制剂的鉴别制剂的鉴别甾体激素类药物原料与制剂甾体激素类药物原料与制剂的鉴别（如：醋酸曲安奈德的鉴别（如：醋酸曲安奈德软膏、醋酸氟轻松软膏）软膏、醋酸氟轻松软膏）方法方法对照品法对照品法对照品法对照品法结果结果判断判断要求供试品溶液所显主要求供试品溶液所显主斑点的颜色和位置与对斑点的颜色和位置与对照品溶液的主斑点相同照品溶液的主斑点相同要求在含量测定项下记录的要求在含量测定项下记录的色谱图中，供试品峰的色谱图中，供试品峰的tR与与对照品峰的对照品峰的tR一致一致第三节第三节 特殊杂质检查特殊杂质检查Ø 杂质来源：杂质来源：原料、中间体、异构体、降解产物以原料、中间体、异构体、降解产物以及试剂和溶剂。

及试剂和溶剂Ø 其他甾体：其他甾体：有些杂质与该有些杂质与该甾体激素药物结构类似甾体激素药物结构类似，，也具有一定的药理作用而又互不相同，因此在甾体激也具有一定的药理作用而又互不相同，因此在甾体激素类药物的质量控制中，素类药物的质量控制中，“其他甾体其他甾体”的限度检查显的限度检查显得很重要得很重要Ø检查方法：检查方法：u判定方法：规定杂质斑点数目判定方法：规定杂质斑点数目 规定杂质斑点颜色规定杂质斑点颜色1 1、、TLCTLC法（自身对照法）法（自身对照法）egeg：氢化可的松中其他甾体的检查：氢化可的松中其他甾体的检查 供试液：本品供试液：本品+ +氯仿氯仿- -甲醇（甲醇（9 9：：1 1）） 浓度：浓度： 对照液：供试液（）对照液：供试液（）+ +氯仿氯仿- -甲醇（甲醇（9 9：：1 1）） 60μg/ml 60μg/ml 层析：供试液层析：供试液 对照液对照液 点样、展开、斑点检出点样、展开、斑点检出 判断：供试液如显杂质斑点，不得多于判断：供试液如显杂质斑点，不得多于3 3个，其颜色与对照液的主个，其颜色与对照液的主斑点比较，不得更深。

斑点比较，不得更深氢化可的松氢化可的松中中其他甾体其他甾体检查检查对照品对照品60μg/ml供试品供试品3.0mg/ml≤≤图图A A中峰中峰1 1面积的四分之三面积的四分之三u判定方法：判定方法： 规定杂质峰数目规定杂质峰数目 规定杂质峰面积规定杂质峰面积2 2、、HPLCHPLC法（法（自身对照法自身对照法））Ø 杂质来源：地塞米松、氟轻松和曲安奈得等甾体激杂质来源：地塞米松、氟轻松和曲安奈得等甾体激素类药物，在生产中使用二氧化硒素类药物，在生产中使用二氧化硒(SeO(SeO2 2) )脱氢工艺，脱氢工艺，药物可能引入杂质硒药物可能引入杂质硒Ø 方法：方法：方法：方法：Ø 结果判断：供试品溶液的吸光度不得大于硒对照溶结果判断：供试品溶液的吸光度不得大于硒对照溶结果判断：供试品溶液的吸光度不得大于硒对照溶结果判断：供试品溶液的吸光度不得大于硒对照溶液的吸光度液的吸光度液的吸光度液的吸光度（（％～％～％）％） egeg：地塞米松磷酸钠：地塞米松磷酸钠Ø 方法：方法：方法：方法：GCGCGCGC色谱法色谱法色谱法色谱法Ø 杂质来源：地塞米松磷酸钠生产中，使用大量杂质来源：地塞米松磷酸钠生产中，使用大量甲醇和丙酮。

甲醇和丙酮Ø 结果判断：不得出现结果判断：不得出现结果判断：不得出现结果判断：不得出现甲醇峰，甲醇含量甲醇峰，甲醇含量≤≤％％ 丙酮规定不得过丙酮规定不得过≤≤5.0%5.0%Ø 方法：对照品（方法：对照品（KH2PO4），磷钼酸比色法），磷钼酸比色法Ø 杂质来源：地塞米松磷酸钠生产过程中，由磷酸酯杂质来源：地塞米松磷酸钠生产过程中，由磷酸酯化时残存的过量磷酸盐化时残存的过量磷酸盐Ø 结果判断：供试品溶液的吸光度不得大于对照溶液的结果判断：供试品溶液的吸光度不得大于对照溶液的结果判断：供试品溶液的吸光度不得大于对照溶液的结果判断：供试品溶液的吸光度不得大于对照溶液的吸光度740nm740nm740nm740nmØ 原理：供试液原理：供试液原理：供试液原理：供试液+ + + +钼酸铵钼酸铵钼酸铵钼酸铵+1-+1-+1-+1-氨基氨基氨基氨基-2--2--2--2-萘酚萘酚萘酚萘酚-4--4--4--4-磺酸磺酸磺酸磺酸 钼蓝钼蓝钼蓝钼蓝第四节第四节 含量测定含量测定有色甲瓒有色甲瓒四氮唑盐四氮唑盐醇酮基醇酮基- -a a- -1717COH -（一）四氮唑盐比色法（一）四氮唑盐比色法（（1 1）原理：肾上腺皮质激素类）原理：肾上腺皮质激素类C C1717-α-α－醇酮基强－醇酮基强还原性。

还原性氯化三苯四氮唑氯化三苯四氮唑（（TTC））三苯甲瓒三苯甲瓒↓深红深红2525℃℃氢氧化四甲基铵氢氧化四甲基铵对照液对照液供试液供试液ATTC40～～45′暗暗（（2 2）方法：对照品法）方法：对照品法（（3 3）影响因素）影响因素A. A. 基团对反应速度的影响基团对反应速度的影响C11= O＞＞C17－－OHC21－－OH未酯化＞未酯化＞C21-OH酯酯化化B、溶剂和水分的影响、溶剂和水分的影响 以无水无醛的乙醇为溶剂，水含量大时，呈以无水无醛的乙醇为溶剂，水含量大时，呈色减慢，不超过色减慢，不超过5％对结果没有影响％对结果没有影响C、、O2与光线的影响与光线的影响避光、隔绝空气、快速、充避光、隔绝空气、快速、充N2除去除去O2D、碱的种类及加入顺序、碱的种类及加入顺序以氢氧化四甲基铵的结果最佳以氢氧化四甲基铵的结果最佳加入顺序：皮质激素溶液加入顺序：皮质激素溶液四氮唑盐四氮唑盐碱试液碱试液皮质激素与碱接触会部分分解皮质激素与碱接触会部分分解E. 温度与时间温度与时间室温（室温（25℃）反应）反应40～～45 minF. 干扰物的影响干扰物的影响 选择性的测定选择性的测定C17位未被氧化和降解的药物位未被氧化和降解的药物氧化物和水解产物不发生反应氧化物和水解产物不发生反应1.原理原理异烟腙（黄）异烟腙（黄）HCl420nm420nm（二）异烟肼比色法（二）异烟肼比色法C C3 3- -酮基酮基+ +异烟肼异烟肼H2O肾上腺皮质激素肾上腺皮质激素 雄性激素雄性激素蛋白同化激素蛋白同化激素孕激素孕激素2.2.方法：对照品法方法：对照品法6060℃℃异烟肼异烟肼无水甲醇无水甲醇对照液对照液供试液供试液A暗暗60′酸性酸性3.3.影响因素影响因素A.反应速度（反应专属性）反应速度（反应专属性）Ø C3=O＞＞C17= O 、、C20= OØ C11= O 不反应不反应B. 溶剂的选择溶剂的选择异烟肼盐酸盐异烟肼盐酸盐→受溶解度的影响受溶解度的影响无水甲醇无水甲醇无水乙醇无水乙醇甲醇对试剂的稳定性好甲醇对试剂的稳定性好甲醇呈色强度较无水乙醇中高甲醇呈色强度较无水乙醇中高乙醇对植物油的溶解度小乙醇对植物油的溶解度小C.水分、温度、水分、温度、O2与光线的影响与光线的影响 Ø 含水量含水量↑→腙水解腙水解↑→A↓→%↓Ø O2与光线对反应的影响不大与光线对反应的影响不大 Ø t℃ ↑ → ν↑D.酸的种类和浓度及异烟肼的浓度酸的种类和浓度及异烟肼的浓度Ø 酸酸:异烟肼异烟肼 = 2:1 吸光度最大吸光度最大Δ4-3-酮基的甾体激素在室温不到酮基的甾体激素在室温不到1h即可定即可定量地与酸性异烟肼反应；其他长时间放置或加量地与酸性异烟肼反应；其他长时间放置或加热后方可反应完全，因此在反应条件下，本法热后方可反应完全，因此在反应条件下，本法对对Δ4-3-酮基甾体具有一定的专属性。

酮基甾体具有一定的专属性E:反应的专属性反应的专属性原理原理λmax=465△△△△桃桃红红黄色黄色雌激素雌激素2 2OH乙醇乙醇- -4 42 2SOHλmax=515又称为铁又称为铁-酚试剂法酚试剂法（三）（三）Kober反应比色法：反应比色法：雌二醇雌二醇-3-甲醚甲醚λλmaxmax=465=465λλmaxmax=515=515•要求：要求：专属性属性强强、灵敏度高；、灵敏度高；–甾体激素甾体激素给药量少；血量少；血药浓度在度在ng/mL；；-灵敏性灵敏性–生物体内有内源性甾体激素，甾体激素生物体内有内源性甾体激素，甾体激素药物在体物在体内有多种代内有多种代谢产物；物；-专属性属性本章小结本章小结•1.结构：三种母核（雄甾烷，雌甾烷，孕甾烷）结构：三种母核（雄甾烷，雌甾烷，孕甾烷）• 各类激素的结构特点各类激素的结构特点•2.性质和鉴别性质和鉴别•与强酸呈色；与强酸呈色；•官能团反应（官能团反应（C17-α-醇酮基；醇酮基；C3-，，C20-酮基；酮基；C17-甲酮基；甲酮基；酚羟基，炔基；卤素；酯反应）酚羟基，炔基；卤素；酯反应）•紫外，红外，色谱紫外，红外，色谱 3. 杂质与检查杂质与检查有关杂质（有关杂质（TLC，，HPLC）；硒的检查；残留溶剂；）；硒的检查；残留溶剂；游离磷酸盐游离磷酸盐4.含量测定含量测定HPLC,UV,比色法（四氮唑盐，异烟肼，比色法（四氮唑盐，异烟肼，Kober反应）反应）简答题：简答题：1 1、简述异烟肼比色法测定甾体类激素药、简述异烟肼比色法测定甾体类激素药物含量的原理及注意事项？物含量的原理及注意事项？2 2、简述四氮唑比色法中的注意事项。

简述四氮唑比色法中的注意事项3 3、甾体类激素药物可能含有哪些特殊杂、甾体类激素药物可能含有哪些特殊杂质？各采用什么方法检查？质？各采用什么方法检查？4 4、甾体类激素药物有哪些鉴别方法？、甾体类激素药物有哪些鉴别方法？。