生物化学实验2动态.ppt

　　　　生物化学实验生物化学实验　　　　河南工业大学生物工程学院河南工业大学生物工程学院　　　　　　生物技术系　　　　　　生物技术系　　　　　　　　　　　　 2015.3 Henan University of Technology编辑ppt实验内容实验内容1.1.　　淀粉含量测定淀粉含量测定2.2.　　氨基酸的纸上层析氨基酸的纸上层析3.　　蛋白质分子量测定蛋白质分子量测定4.　　淀粉酶活力测定淀粉酶活力测定￿5.　　蛋白质含量测定蛋白质含量测定1.6.　　甲醛滴定测氨基氮甲醛滴定测氨基氮￿2.7.　　酵母酵母RNA的提取、组分鉴定和含量测定的提取、组分鉴定和含量测定3.8.￿￿￿赖氨酸含量测定赖氨酸含量测定9.￿￿￿凝胶层析法分离蛋白质凝胶层析法分离蛋白质10.￿蔗糖酶的提取与部分纯化蔗糖酶的提取与部分纯化11.￿蔗糖酶活力的测定蔗糖酶活力的测定12.￿Bradford法测定蛋白质含量法测定蛋白质含量编辑ppt教学目的教学目的　　　　　　     ￿￿生生物物化化学学是是专专业业基基础础实实验验课课，，其其先先修修课课程程为为无无机机化化学学、、分分析析化化学学和和有有机机化化学学￿。

其其目目的的是是：：学习和掌握生物技术，培养动手观察和思维能力学习和掌握生物技术，培养动手观察和思维能力编辑ppt学习方法学习方法1 1、、预预习习：：实实验验前前必必须须进进行行充充分分的的预预习习和和准准备备，，并并写写出出预预习习报报告告，，做做到到心心中中有数，这是做好实验的前提有数，这是做好实验的前提2 2、、操操作作：：应应按按拟拟定定的的实实验验操操作作计计划划与与方方案案进进行行做做到到轻轻（（动动作作轻轻、、讲讲话话轻轻）），，细细（（细细心心观观察察、、细细致致操操作作）），，准准（（试试剂剂用用量量准准确确、、结结果果及及其其记记录录准准确确）），洁（使用的仪器清洁，实验桌面整洁，实验结束把实验室打扫清洁）洁（使用的仪器清洁，实验桌面整洁，实验结束把实验室打扫清洁）3 3、、在在实实验验全全过过程程中中，，应应集集中中注注意意力力，，独独立立思思考考解解决决问问题题自自己己难难以以解解释释时时可请老师解答可请老师解答4 4、、写写实实验验报报告告：：做做完完实实验验后后，，应应解解释释实实验验现现象象，，并并作作出出结结论论，，或或根根据据实实验验数数据据进进行行计计算算和和处处理理。

主主要要包包括括：：a a、、目目的的，，b b、、原原理理，，c c、、操操作作步步骤骤及及实实验验性性质质、、现现象象，，d d、、数数据据处处理理（（含含误误差差原原因因及及分分析析）），，e e、、讨讨论论，，f f、、思思考考题回答编辑ppt实验室守则实验室守则　　　　生物化学实验室守则是学生实验正常进行的保证，学生进入实验室必须遵守生物化学实验室守则是学生实验正常进行的保证，学生进入实验室必须遵守以下规则：以下规则：1.￿￿￿进入实验室，须遵守实验室纪律和制度，听从老师指导进入实验室，须遵守实验室纪律和制度，听从老师指导￿2.￿￿￿未穿实验服、未写实验预习报告者不得进入实验室进行实验未穿实验服、未写实验预习报告者不得进入实验室进行实验3.￿￿￿进入实验室后，要熟悉周围环境，熟悉防火及急救设备器材的使用方法和存放位置，进入实验室后，要熟悉周围环境，熟悉防火及急救设备器材的使用方法和存放位置，遵守安全规则遵守安全规则￿4.￿￿￿实验前，清点、检查仪器、明确仪器规范操作方法及注意事项，否则不得动手操作实验前，清点、检查仪器、明确仪器规范操作方法及注意事项，否则不得动手操作￿￿￿￿￿5.￿￿￿使用药品时，要求明确其性质及使用方法后，据实验要求规范使用。

禁止使用不明确使用药品时，要求明确其性质及使用方法后，据实验要求规范使用禁止使用不明确药品或随意混合药品药品或随意混合药品6.￿￿￿实验中，保持安静，认真操作，仔细观察，积极思维，实验中，保持安静，认真操作，仔细观察，积极思维，实验过程中必须有原始记录实验过程中必须有原始记录，，不得擅自离开岗位不得擅自离开岗位7.￿￿￿实验室公用物品（包括器材、药品等）用完后，应归放回原指定位实验室公用物品（包括器材、药品等）用完后，应归放回原指定位置实验废液、废实验废液、废物按要求放入指定收集器皿物按要求放入指定收集器皿8.￿￿￿爱护公物，注意卫生，保持整洁，节约用水、电、气及器材爱护公物，注意卫生，保持整洁，节约用水、电、气及器材9.￿￿￿实验完毕后，要求整理、清洁实验台面，检查水、电、气源，打扫实验室卫生实验完毕后，要求整理、清洁实验台面，检查水、电、气源，打扫实验室卫生￿10.￿实验记录经教师签名认可后，方可离开实验室实验记录经教师签名认可后，方可离开实验室￿￿￿￿￿编辑ppt实验一　淀粉含量测定实验一　淀粉含量测定一、实验目的一、实验目的1.　掌握旋光仪的操作使用　掌握旋光仪的操作使用 2.　了解旋光法测粗淀粉的基本原理。

　了解旋光法测粗淀粉的基本原理二、实验原理二、实验原理 v在在加加热热及及稀稀盐盐酸酸的的作作用用下下，，淀淀粉粉水水解解并并转转入入盐盐酸酸溶溶液液中中在在一一定定的的水水解解条条件件下下，，不不同同谷谷物物淀淀粉粉的的比比旋旋光光度度是是不不同同的的其其在在171～～195之之间间，，因因此此可可用用旋旋光法测定粗淀粉的含量光法测定粗淀粉的含量编辑ppt三、实验仪器和试剂三、实验仪器和试剂1、主要、主要仪器：仪器：（（1））旋光仪旋光仪（（2）电子）电子天平（感量天平（感量0.0001g））2、、试剂：试剂：   ⑴⑴1％盐酸溶液％盐酸溶液   ⑵⑵30％硫酸锌溶液％硫酸锌溶液   ⑶⑶15％亚铁氰化钾溶液％亚铁氰化钾溶液编辑ppt四、实验步骤四、实验步骤1.样品的处理样品的处理        在电子天平上称取小麦粉在电子天平上称取小麦粉2.5000g置于三角瓶中置于三角瓶中→加入加入50mL 1%HCl混成浆状（不能有结块）混成浆状（不能有结块）→沸水浴中准确加热沸水浴中准确加热15min→先加先加1mL 30% ZnSO4混匀混匀→再加再加1mL 15%亚铁氰亚铁氰化钾混匀化钾混匀→移至移至100mL容量瓶中加水定容混匀后过滤容量瓶中加水定容混匀后过滤→弃去弃去最初最初15mL收集其余滤液收集其余滤液。

2.旋光度测定旋光度测定       取滤液取滤液20mL置于旋光管中，先用置于旋光管中，先用1%HCl 调节旋光仪调节旋光仪“0”点，然后将样品溶液放入旋光仪中测点，然后将样品溶液放入旋光仪中测α编辑pptv五五 、、 结果计算结果计算其中其中：：编辑ppt六、思考题六、思考题v样样品品加加盐盐酸酸处处理理时时，，煮煮沸沸时时间间少少于于或或多多于于15min会会对对测测定定结果产生什么影响？结果产生什么影响？编辑ppt实验二　实验二　氨基酸的纸上层析氨基酸的纸上层析　　一、实验目的一、实验目的     通过对氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法通过对氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法二、实验原理二、实验原理    纸纸层层析析是是以以滤滤纸纸作作为为惰惰性性支支持持物物的的分分配配层层析析，，滤滤纸纸纤纤维维上上的的－－OH具具有有亲亲水水性性，，因因此此能能吸吸附附一一层层水水作作为为固固定定相相，，而而通通常常把把有有机机溶溶剂剂作作为为流流动动相相有有机机溶溶剂剂自自上上而而下下流流动动，，称称为为下下行行层层析析；；自自下下而而上上流流动动，，称称为为上上行行层层析析。

流流动动相相流流经经支支持持物物时时与与固固定定相相之之间间连连续续抽抽提提，，使使物物质质在在两两相相之之间间不不断断分分配配而而得得到到分离编辑ppt三、仪器和试剂三、仪器和试剂1、主要、主要仪器：仪器：（（1）层析缸）层析缸（（2））微量进样器微量进样器（（3）喷雾器）喷雾器2、、试剂试剂 ：：（（1）展）展开开剂：剂：乙醇：水：冰乙酸＝乙醇：水：冰乙酸＝50:10:1  （（2）氨基酸溶液：）氨基酸溶液：0.5%的赖氨酸、脯氨酸、的赖氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸苯丙氨酸溶液溶液及它们的混合液及它们的混合液  （（3）显色剂：）显色剂：0.1%水合茚三酮丙酮溶液水合茚三酮丙酮溶液编辑ppt四、实验步骤四、实验步骤1、、平平衡衡：：将将展展开开剂剂（（乙乙醇醇：：水水：：冰冰乙乙酸酸＝＝50:10:1））放放入入培培养养         皿中置于密闭容器内使其充满展开剂（皿中置于密闭容器内使其充满展开剂（24h左右）左右）2、、点点样样：：取取滤滤纸纸1张张用用铅铅笔笔在在距距下下方方2cm处处划划线线并并将将所所得得线线段段分分成成5等等分分从从而而得得到到4个个标标记记点点，，用用微微量量进进样样器器分分别别取取5μL下下列列样样品品①①phe②②lys③③pro④④混混合合Aa向向4个个标标记记点点上上加加样样（（样样品品扩扩散中散中Ø≤1cm））3、、展展层层：：将将滤滤纸纸卷卷成成筒筒状状且且不不能能够够重重叠叠，，并并用用棉棉线线扎扎紧紧然然后后垂垂直直放放入入培培养养皿皿中中进进行行展展层层2h（（当当展展开开剂剂沿沿到到达达滤滤纸纸长长度度三三分分之之二时，即可取出）测量展开剂前沿移动距离（二时，即可取出）测量展开剂前沿移动距离（a））4、、显显色色：：用用0.1%茚茚三三酮酮-丙丙酮酮溶溶液液朝朝点点样样面面喷喷雾雾（（不不要要喷喷得得太太多多））然然后后将将滤滤纸纸置置于于电电炉炉上上方方20cm处处加加热热直直至至斑斑点点出出现现为为止止，，测量各斑点中心到点样点距离（测量各斑点中心到点样点距离（b））编辑pptv1．计算出各种氨基酸的．计算出各种氨基酸的Rf值，并根据值，并根据Rf值鉴定出混值鉴定出混合氨基酸中的各组分，在层析图谱上标出各氨基酸合氨基酸中的各组分，在层析图谱上标出各氨基酸名称。

名称v2．对氨基酸移动快慢的原因给予简要分析．对氨基酸移动快慢的原因给予简要分析五、结果计算五、结果计算六、思考题六、思考题编辑ppt实验三　蛋白质分子量测定实验三　蛋白质分子量测定一、实验目的一、实验目的             掌掌握握电电泳泳基基本本原原理理、、分分类类、、影影响响因因素素, SDS-聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶电泳用途胶电泳用途,凝胶制备凝胶制备二、实验原理二、实验原理　　 聚丙烯聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子质量的方法，酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子质量的方法，主要是根据各蛋白质组分的分子大小和形状以及所带净电荷主要是根据各蛋白质组分的分子大小和形状以及所带净电荷多少等因素所造成的电泳迁移率的差别多少等因素所造成的电泳迁移率的差别 在聚丙烯酰胺凝胶在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），使所有蛋），使所有蛋白质颗粒表面覆盖一层白质颗粒表面覆盖一层SDS分子，导致蛋白质分子间原有的分子，导致蛋白质分子间原有的电荷差异消失，此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于电荷差异消失，此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小。

当蛋白质的分子量在它的分子量大小当蛋白质的分子量在15000～～200000之间之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈直线关系时，电泳迁移率与分子量的对数呈直线关系编辑ppt三、仪器和试剂三、仪器和试剂1．．主要仪器主要仪器（（1））电泳仪电泳仪（（2））电泳槽电泳槽2. 试剂试剂（（1）电极缓冲液）电极缓冲液（（2）） pH 7.2 凝胶缓冲液凝胶缓冲液（（3））1%TEMED，，（（4））30%凝胶凝胶储储液，液，（（5））10%过硫酸铵过硫酸铵（（6））0.1%考马斯亮蓝考马斯亮蓝R250染色液染色液（（7））10%乙酸乙酸脱色液脱色液编辑ppt四、实验步骤四、实验步骤1. 电泳槽的安装：取两块玻璃板电泳槽的安装：取两块玻璃板→将带玻璃条的板（高板）放置桌面上将带玻璃条的板（高板）放置桌面上→在上面放置在上面放置“U”型橡胶条型橡胶条→最后将凹槽玻璃板（低板）压在高板上，置最后将凹槽玻璃板（低板）压在高板上，置于电泳槽内，用锲子压紧于电泳槽内，用锲子压紧2. 凝胶液的制备与灌装：配置凝胶液的制备与灌装：配置20mL凝胶液：在小烧杯中依次加入凝胶液：在小烧杯中依次加入5mL 30%凝胶凝胶储储液，液，10mL pH 7.2 凝胶缓冲液凝胶缓冲液(用前混匀再取用前混匀再取)，，2mL 1%TEMED，，2.6mL重蒸重蒸水，水，0.4mL 10%过硫酸铵混匀过硫酸铵混匀后后→立即沿高板立即沿高板内侧倒凝胶液于两板之间直至低板上沿内侧倒凝胶液于两板之间直至低板上沿→插上梳子插上梳子置于置于30ºC培养箱中培养箱中放放置置15min，待胶凝后取下，待胶凝后取下“U”条条→重新将胶板放置于电泳槽内重新将胶板放置于电泳槽内→向外槽向外槽内加三分之一槽深电极缓冲液内加三分之一槽深电极缓冲液→向内槽加入电极缓冲液没过低板向内槽加入电极缓冲液没过低板→最后最后拔出梳子。

拔出梳子3. 加样：用微量进样器加入加样：用微量进样器加入10μL标准蛋白于中间胶槽内标准蛋白于中间胶槽内→其余槽内加入其余槽内加入10μL下列样品下列样品①①牛血清蛋白牛血清蛋白②②绿豆分绿豆分离离蛋白蛋白4. 电泳：连接电极线，高板外侧接正极，低板内侧槽接负极，打开电源电泳：连接电极线，高板外侧接正极，低板内侧槽接负极，打开电源→调电流调电流120mA→电泳电泳2h（当指示剂前沿超过二分之一胶长时停止）（当指示剂前沿超过二分之一胶长时停止）5. 剥胶：取下胶板倒去电极缓冲液剥胶：取下胶板倒去电极缓冲液→测测量指示剂迁移距离和染色前胶长，量指示剂迁移距离和染色前胶长，然后将胶板置于水龙头下方冲玻板四周直至胶与玻璃板然后将胶板置于水龙头下方冲玻板四周直至胶与玻璃板分分离离6. 染色与固定：将胶板放入染色盒内染色与固定：将胶板放入染色盒内→向其中加入向其中加入0.1%考马斯亮蓝考马斯亮蓝R250使使其浸没置于摇床上染色过夜其浸没置于摇床上染色过夜7. 脱色：用脱色：用10%乙酸溶液脱色至谱带清晰，测定脱色后胶长及各谱带迁移乙酸溶液脱色至谱带清晰，测定脱色后胶长及各谱带迁移距离编辑ppt五五 、、 结果计算结果计算1、计算相对迁移率：、计算相对迁移率：2、以相对迁移率、以相对迁移率MR为横坐标、为横坐标、LgMr为纵坐标，为纵坐标，作出分子量标准曲线。

作出分子量标准曲线3、求分子量、求分子量编辑ppt　　五、注意事项五、注意事项v1．．30%Acr-Bis是神经毒化合物，操作时要小心，做好个是神经毒化合物，操作时要小心，做好个人防护人防护v2．过硫酸铵需现用现配．过硫酸铵需现用现配v3．过硫酸铵和．过硫酸铵和TEMED在灌胶前加入即可在灌胶前加入即可v4．用微量加样器上样时，勿刺破胶面．用微量加样器上样时，勿刺破胶面 根据本实验所学知识，自行设计豌豆凝集素的分离纯化实验根据本实验所学知识，自行设计豌豆凝集素的分离纯化实验六、思考题六、思考题编辑ppt实验四　淀粉酶活力测定实验四　淀粉酶活力测定 一、实验目的一、实验目的          学学习习和和掌掌握握测测定定淀淀粉粉酶酶（（包包括括α-淀淀粉粉酶酶和和β-淀淀粉粉酶酶））活活力力的原理和方法的原理和方法二、实验原理二、实验原理          淀淀粉粉酶酶主主要要包包括括α-淀淀粉粉酶酶和和β-淀淀粉粉酶酶两两种种α-淀淀粉粉酶酶可可作作用用于于淀淀粉粉中中的的α-1,4-糖糖苷苷键键，，生生成成葡葡萄萄糖糖、、麦麦芽芽糖糖、、麦麦芽芽三三糖糖、、糊糊精精等等还还原原糖糖，，β-淀淀粉粉酶酶可可从从淀淀粉粉的的非非还还原原性性末末端端进进行行水水解解，，生生成成麦麦芽芽糖糖。

淀淀粉粉酶酶催催化化产产生生的的这这些些还还原原糖糖能能使使3,5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3-氨基氨基-5-硝基水杨酸硝基水杨酸编辑ppt其反应如其反应如右图右图：：淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比用标准浓度的淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力糖的量表示酶活力淀粉酶存在于萌发后的禾谷类种子中，，其中主要是淀粉酶存在于萌发后的禾谷类种子中，，其中主要是α-淀粉酶淀粉酶和和β-淀粉酶两种淀粉酶特性不同，淀粉酶两种淀粉酶特性不同，α-淀粉酶不耐酸，在淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化以下迅速钝化β-淀粉酶不耐热，在淀粉酶不耐热，在70℃15min钝化根据它们的这种特性，采用加热的方法钝化根据它们的这种特性，采用加热的方法钝化β-淀粉酶，测出淀粉酶，测出α-淀粉酶的活力在非钝化条件下测定淀粉酶总活力（淀粉酶的活力。

在非钝化条件下测定淀粉酶总活力（α-淀粉酶淀粉酶活力活力+β-淀粉酶活力），再减去淀粉酶活力），再减去α-淀粉酶的活力，就可求出淀粉酶的活力，就可求出β-淀粉酶的活力淀粉酶的活力编辑ppt三、仪器和试剂三、仪器和试剂v主要主要仪器：仪器：v（（1）离心机）离心机v（（2）分光光度计）分光光度计v试剂试剂v（（1）标准麦芽糖溶液（）标准麦芽糖溶液（2mg/mL））v（（2））1%3,5-二硝基水杨酸试剂二硝基水杨酸试剂v（（3））1%淀粉淀粉编辑ppt四、操作步骤四、操作步骤以麦芽糖含量以麦芽糖含量（（mg））为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线1．标准曲线的制作．标准曲线的制作（每（每2组组4人做人做1标准曲线）标准曲线）       编辑ppt 2. 淀粉酶液的制备：淀粉酶液的制备：     在电子天平上称取小麦芽（在在电子天平上称取小麦芽（在9428冰箱内，用后放回）冰箱内，用后放回）0.5g置于研钵中置于研钵中加加20mL水研成浆状水研成浆状→转移至离心管中转移至离心管中2000转转/分离心分离心5min（注意离心前（注意离心前对称放置的离心管应在天平上平衡）对称放置的离心管应在天平上平衡）→取上清液于取上清液于100mL容量瓶中加水容量瓶中加水定容混匀定容混匀→即得淀粉酶原液即得淀粉酶原液→用于用于α-淀粉酶活力测定淀粉酶活力测定     吸取原液吸取原液5mL于于100mL容量瓶中加水定容即得淀粉酶稀释液容量瓶中加水定容即得淀粉酶稀释液→用于总酶用于总酶活力测定。

活力测定3. 淀粉酶活力测定淀粉酶活力测定   ①①α-淀粉酶活力测定淀粉酶活力测定      吸取原液吸取原液1mL于具塞试管中于具塞试管中→70℃℃保温保温15min用于钝化用于钝化β-淀粉酶淀粉酶→加加1mL 1%淀粉置于淀粉置于40℃℃水浴中保温水浴中保温5min→加加1% 3.5一二硝基水杨酸一二硝基水杨酸2mL 沸水加热沸水加热5min后加水至后加水至20mL混匀测混匀测A1（（用用1#管调零管调零））  ②②总酶活力测定总酶活力测定     吸取稀释液吸取稀释液1mL于具塞试管中于具塞试管中→加加1mL 1%淀粉淀粉40℃℃保存保存5min→加入加入1% 3.5一二硝基水杨酸一二硝基水杨酸2mL沸水加热沸水加热5min后加水至后加水至20mL混匀测混匀测A2（（用用1#管管调零调零））编辑ppt五、结果计算五、结果计算　　　　　　　β-淀粉酶活力＝（淀粉酶活力＝（α＋＋β）淀粉酶总活力－）淀粉酶总活力－α-淀淀粉酶活力粉酶活力编辑ppt六、附六、附  注注v1．样品提取液的定容体积和酶液稀释倍数可根据不同材．样品提取液的定容体积和酶液稀释倍数可根据不同材料酶活性的大小而定。

料酶活性的大小而定v2．为了确保酶促反应时间的准确性，在进行保温这一步．为了确保酶促反应时间的准确性，在进行保温这一步骤时，可以将各试管每隔一定时间依次放入恒温水浴，准骤时，可以将各试管每隔一定时间依次放入恒温水浴，准确记录时间，到达确记录时间，到达5min时取出试管，立即加入时取出试管，立即加入3,5-二硝基二硝基水杨酸以终止酶反应，以便尽量减小因各试管保温时间不水杨酸以终止酶反应，以便尽量减小因各试管保温时间不同而引起的误差同时恒温水浴温度变化应不超过同而引起的误差同时恒温水浴温度变化应不超过±0.5℃℃v3．如果条件允许，各实验小组可采用不同材料，例如萌．如果条件允许，各实验小组可采用不同材料，例如萌发发1d、、2d、、3d、、4d的小麦种子，比较测定结果，以了解的小麦种子，比较测定结果，以了解萌发过程中这两种淀粉酶活性的变化萌发过程中这两种淀粉酶活性的变化编辑ppt七、思考题七、思考题v1．为什么要将试管中的淀粉酶原液置．为什么要将试管中的淀粉酶原液置70℃℃水浴中水浴中保温保温15min？？v2．为什么要将各试管中的淀粉酶原液和．为什么要将各试管中的淀粉酶原液和1%淀粉淀粉溶液分别置于溶液分别置于40℃℃水浴中保温？水浴中保温？编辑ppt实验五　蛋白质含量的测定实验五　蛋白质含量的测定一、实验目的一、实验目的          学习凯氏定氮法的原理和操作技术。

学习凯氏定氮法的原理和操作技术二、实验原理二、实验原理          含氮的有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢二元素被氧化成二氧化含氮的有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢二元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵碳和水，而氮则转变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵          浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸汽将产生的氨蒸浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到一定浓度的过量硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中氢离子浓度降馏到一定浓度的过量硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中氢离子浓度降低，然后用标准无机酸滴定，直到恢复溶液中原来氢离子浓度为止，最低，然后用标准无机酸滴定，直到恢复溶液中原来氢离子浓度为止，最后根据所用标准酸的摩尔数（相当于待测物中氨的摩尔数）计算出待测后根据所用标准酸的摩尔数（相当于待测物中氨的摩尔数）计算出待测物中的总氮量物中的总氮量编辑ppt二、实验原理二、实验原理           含氮的有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢二元素被含氮的有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢二元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，并进一步与硫酸作氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。

用生成硫酸铵           浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸汽浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到一定浓度的过量硼酸溶液中，硼酸吸收氨将产生的氨蒸馏到一定浓度的过量硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中氢离子浓度降低，然后用标准无机酸滴定，直到后使溶液中氢离子浓度降低，然后用标准无机酸滴定，直到恢复溶液中原来氢离子浓度为止，最后根据所用标准酸的摩恢复溶液中原来氢离子浓度为止，最后根据所用标准酸的摩尔数（相当于待测物中氨的摩尔数）计算出待测物中的总氮尔数（相当于待测物中氨的摩尔数）计算出待测物中的总氮量编辑ppt三、实验试剂、器材三、实验试剂、器材1．．主要仪主要仪器器v(1)凯氏定氮蒸馏装置凯氏定氮蒸馏装置v(2)消化炉消化炉v(3)电子电子天平天平 2．．试剂试剂v(1)浓硫酸（化学纯）浓硫酸（化学纯）v(2)硫酸钾硫酸钾-硫酸铜混合硫酸铜混合催化剂催化剂v(3)甲基红甲基红-溴甲酚绿混合指剂溴甲酚绿混合指剂v(4)2%硼酸溶液硼酸溶液v(5)0.01mol/L HCl标准盐酸溶液标准盐酸溶液v(6)40%NaOH编辑ppt四、操作步骤四、操作步骤v1、消化：在电子天平上称取小麦粉、消化：在电子天平上称取小麦粉0.2000g--0.4000g 置于凯氏试管底部置于凯氏试管底部→加混加混合混合催化剂合混合催化剂0.5g和和3mL浓硫酸置于消化炉中高温加热至淡绿色透明（浓硫酸置于消化炉中高温加热至淡绿色透明（2h左右）左右）取出放入通风橱内至不冒白烟，向其中加取出放入通风橱内至不冒白烟，向其中加20mL水，并移至水，并移至100mL容量瓶定容容量瓶定容→即得样品消化液。

即得样品消化液v  同时每同时每4组组8人做人做1空白实验：空白实验：0.5g混合催化剂混合催化剂+3mL浓硫酸置于凯氏试管中放入浓硫酸置于凯氏试管中放入消化炉加热至淡绿色（消化炉加热至淡绿色（1h左右）左右）→冷却后加水移入冷却后加水移入100mL容量瓶中定容得空白容量瓶中定容得空白消化液v2. 蒸馏与吸收：吸取蒸馏与吸收：吸取10mL 2%的硼酸于三角瓶中的硼酸于三角瓶中→加加4d甲基红甲基红-溴甲酚绿混合溴甲酚绿混合指示剂（若变绿色则用指示剂（若变绿色则用0.01mol/L HCl调至紫红色）将其置于冷凝管下端并使调至紫红色）将其置于冷凝管下端并使管尖插入液面以下，再吸取管尖插入液面以下，再吸取5mL消化液从漏斗上方加入蒸馏室内用水洗两次，消化液从漏斗上方加入蒸馏室内用水洗两次，并加入并加入10mL 40%NaOH后水封（注意：勿使漏斗内玻杆取下以防漏气），然后后水封（注意：勿使漏斗内玻杆取下以防漏气），然后打开通气阀进行加热蒸馏，直至吸收液由紫红色变成绿色，计时蒸馏打开通气阀进行加热蒸馏，直至吸收液由紫红色变成绿色，计时蒸馏3min→先先移去吸收液再停止加热以防倒吸移去吸收液再停止加热以防倒吸。

v3. 滴定：用滴定：用0.01mol/L HCl 滴定吸收液由绿色退去变红色为止，记下耗去标准滴定吸收液由绿色退去变红色为止，记下耗去标准盐酸的体积盐酸的体积(V1.V0)编辑ppt　　　v   C：标准盐酸溶液摩尔浓度：标准盐酸溶液摩尔浓度(0.01)vV1：滴定样品用去的盐酸溶液平均毫升数滴定样品用去的盐酸溶液平均毫升数vV0：滴定空白消化液用去的盐酸溶液平均毫升数滴定空白消化液用去的盐酸溶液平均毫升数vW：样品重量（：样品重量（mg）v14.01：氮的原子量氮的原子量vK=5.7vM=12.5%vV2=100mLvV3=5mL五、结果计算五、结果计算编辑ppt实验六实验六 甲醛滴定测氨基氮甲醛滴定测氨基氮 一、实验目的一、实验目的v1．加深对氨基酸两性解离的认识．加深对氨基酸两性解离的认识v2．掌握甲醛滴定法的原理及应用．掌握甲醛滴定法的原理及应用编辑ppt三、实验仪器、试剂及材料三、实验仪器、试剂及材料1. 实验仪器：实验仪器：   v 微量碱式滴定管（微量碱式滴定管（10mL）、）、2. 试剂：试剂：    v (1)．．0.5％酚酞指示剂：％酚酞指示剂：v (2)．．1％甘氨酸％甘氨酸即即1克加克加100mL水配制而成水配制而成v (3)．．0.1mol／／L标准氢氧化钠溶液（使用前需标定）。

标准氢氧化钠溶液（使用前需标定）v (4)．中性甲醛溶液：取分析纯甲醛．中性甲醛溶液：取分析纯甲醛(36％～％～37％％)溶液溶液20mL，加，加0.5％酚酞指示剂约％酚酞指示剂约3滴滴，滴加，滴加0.100mol／／L的氢的氢氧化钠溶液，使溶液呈微粉红色（临用前中和）氧化钠溶液，使溶液呈微粉红色（临用前中和）编辑pptv氨基酸为两性离子，在水溶液中有下列平衡：氨基酸为两性离子，在水溶液中有下列平衡：v    RCHCOO- +2HCHO ＝＝ RCHCOO- + H+v            ↓                                  ↓v           NH3+                          N(CH2OH)2v                                      v常温下甲醛能迅速与氨基酸的氨基结合生成亚羟甲基化合物，常温下甲醛能迅速与氨基酸的氨基结合生成亚羟甲基化合物，使上述平衡右移促使使上述平衡右移促使NH3+释放释放H+，从而使溶液酸度增加，，从而使溶液酸度增加，滴定终点移至酚酞的变色域内（滴定终点移至酚酞的变色域内（pH值值9.0左右），左右），根据滴定根据滴定终点时所消耗标准碱的量即可算出反应体系中存在的游离氨终点时所消耗标准碱的量即可算出反应体系中存在的游离氨基即氨基氮的含量如果样品为一种已知的氨基酸，即可算出基即氨基氮的含量如果样品为一种已知的氨基酸，即可算出该氨基酸的含量。

如果样品为未知氨基酸或几种氨基酸的混该氨基酸的含量如果样品为未知氨基酸或几种氨基酸的混合物，则只能算出其氨基氮的含量合物，则只能算出其氨基氮的含量           二、实验原理二、实验原理编辑ppt四、操作方法四、操作方法v 已知氨基酸溶液中氨基酸含量的测定已知氨基酸溶液中氨基酸含量的测定:v 取取3只三角瓶编号只三角瓶编号①①2mL 1% 甘氨酸甘氨酸②②2mL 1% 甘甘氨酸氨酸③③2mL 水（空白）水（空白）v均加均加5mL 水和水和5mL中性甲醛（用前加中性甲醛（用前加2滴滴 0.5% 酚酚酞滴加酞滴加0.1mol/LNaOH调至淡红色），及调至淡红色），及4滴滴 0.5%酚酞混匀酚酞混匀→用用0.1mol/L滴至粉红色出现为止滴至粉红色出现为止→分别分别记下耗去标准碱的体积记下耗去标准碱的体积(V1.V2.V0））   编辑ppt五、结果处理与计算五、结果处理与计算式中：式中：V：滴定样品所消耗标准碱的：滴定样品所消耗标准碱的平均平均体积（体积（mL）         V0：滴定空白所消耗标准碱的体积（：滴定空白所消耗标准碱的体积（mL）         C：滴定时用标准氢氧化钠的浓度（：滴定时用标准氢氧化钠的浓度（0.1mol／／L））.          14.01：氮的：氮的摩尔摩尔质量。

质量    编辑pptv说明：说明：v    1.本法优点是简单快速，缺点是不够准确，其准本法优点是简单快速，缺点是不够准确，其准确度仅达到氨基酸或氨基氮理论含量的确度仅达到氨基酸或氨基氮理论含量的90％而且，如果样品液中含有脯氨酸或酪氨酸时滴定误差且，如果样品液中含有脯氨酸或酪氨酸时滴定误差更大，因为脯氨酸与甲醛作用后生成不稳定化合物更大，因为脯氨酸与甲醛作用后生成不稳定化合物使结果偏低，酪氨酸的酚基结构又使结果偏高使结果偏低，酪氨酸的酚基结构又使结果偏高v    2．甲醛滴定法常用以测定蛋白质的水解程度．甲醛滴定法常用以测定蛋白质的水解程度v    3．中性甲醛需临用前配制放置一段时间后，．中性甲醛需临用前配制放置一段时间后，在使用前需重新中和在使用前需重新中和编辑ppt六、思考题六、思考题     为什么说甲醛滴定法可以测定蛋白为什么说甲醛滴定法可以测定蛋白质的水解程度？除此之外还有哪些质的水解程度？除此之外还有哪些方法可以用来测定蛋白质的水解程方法可以用来测定蛋白质的水解程度？度？ 编辑ppt实验七　酵母实验七　酵母RNA的提取、组分鉴定和含的提取、组分鉴定和含量测定量测定一、实验目的一、实验目的v（（1）了解并掌握稀碱法提取酵母）了解并掌握稀碱法提取酵母RNA的原理和方法。

的原理和方法v（（2）了解核酸的组分并掌握其鉴定方法了解核酸的组分并掌握其鉴定方法v（（3）掌握地衣酚显色法测定酵母）掌握地衣酚显色法测定酵母RNA含量的原理和方法含量的原理和方法编辑ppt二、实验原理二、实验原理v酵母含酵母含RNA达达2.67—10.0%，以酵母为原料使用稀碱使酵，以酵母为原料使用稀碱使酵母裂解，然后用酸中和母裂解，然后用酸中和,除去蛋白质和菌体后的上清液用乙除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀醇沉淀RNA由此得到的由此得到的RNA为变性的为变性的RNA，可用作制备，可用作制备核苷酸的原料核苷酸的原料   用硫酸水解用硫酸水解RNA后后,可生成磷酸、戊糖和碱基可生成磷酸、戊糖和碱基,各成分用以各成分用以下反应加以鉴定：下反应加以鉴定：（（1）磷酸与钼酸铵试剂作用可生成黄色磷钼酸铵沉淀磷酸与钼酸铵试剂作用可生成黄色磷钼酸铵沉淀2）核糖与地衣酚试剂作用呈鲜绿色核糖与地衣酚试剂作用呈鲜绿色3）嘌呤碱与硝酸银反应可生成白色的嘌呤银化物沉淀嘌呤碱与硝酸银反应可生成白色的嘌呤银化物沉淀vRNA与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变成糠醛，后者与成糠醛，后者与3，， 5-二羟甲苯（地衣酚或苔黑酚）反应呈二羟甲苯（地衣酚或苔黑酚）反应呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁和氯化铜作催化剂，反应产鲜绿色，该反应需用三氯化铁和氯化铜作催化剂，反应产物在物在670nm处有最大吸收。

处有最大吸收RNA在在20－－250微克范围内，微克范围内，光吸收与光吸收与RNA浓度浓度 成正比编辑ppt三、仪器和试剂三、仪器和试剂v1. 主要试剂主要试剂v（（1）酵母粉）酵母粉 v（（2））0.04M NaOH溶液溶液v（（3））1.5M硫酸硫酸v（（4）无水乙醚）无水乙醚v（（5））95％乙醇％乙醇v（（6）浓氨水）浓氨水v（（7）酸性乙醇溶液）酸性乙醇溶液v （（8）浓硝酸）浓硝酸v（（9））0.1M AgNO3 v（（10）三氯化铁）三氯化铁-盐酸溶液盐酸溶液v（（11）钼酸铵试剂）钼酸铵试剂v（（12））50ug∕mLRNA标准溶液标准溶液编辑pptv（（13）苔黑酚）苔黑酚(3,5-二羟基甲苯二羟基甲苯)乙醇溶液乙醇溶液v（（14）地衣酚）地衣酚-铜离子试剂铜离子试剂v2、器材：、器材：v（（1）离心机）离心机v（（2）分光光度计）分光光度计v（（3）抽滤装置抽滤装置 v（（4））电子天平电子天平编辑ppt四、实验步骤四、实验步骤v1、酵母、酵母RNA提取提取v称称5g干酵母粉干酵母粉于研钵于研钵中中加入加入20mL 0.04M NaOH溶液并研成浆状溶液并研成浆状后后转入转入三角烧瓶中三角烧瓶中，，再用再用10mL 0.04M NaOH溶液洗涤并转入三角烧瓶中，沸溶液洗涤并转入三角烧瓶中，沸水浴加热水浴加热30min，冷却，冷却后后转入离心管转入离心管并用并用5mL0.04MNaOH溶溶液洗涤液洗涤三角三角瓶瓶,3000r/min离心离心15min，将上清慢慢倾入，将上清慢慢倾入 10mL酸性乙醇酸性乙醇的烧杯中的烧杯中，，边加边搅动。

静置边加边搅动静置1min待待RNA沉淀完全后，沉淀完全后，3000r/min离心离心3min弃去上清液上清液，用药勺将沉淀取出放入，用药勺将沉淀取出放入布氏漏斗布氏漏斗中（漏斗内有已中（漏斗内有已称重称重W1滤纸滤纸））抽滤抽滤，先，先用用95％乙醇％乙醇10 mL洗涤沉淀洗涤沉淀，，再用乙醚再用乙醚10 mL洗涤沉淀，沉淀洗涤沉淀，沉淀在空气中干燥在空气中干燥30min后，再至于电炉上方后，再至于电炉上方20cm处干燥至恒重处干燥至恒重称量所得称量所得RNA粗品和滤纸重粗品和滤纸重W2W2- W1即为粗即为粗提提RNA重量重量编辑pptv2. RNA含量测定含量测定v（（1）标准曲线的制作：（每）标准曲线的制作：（每4组组8人做人做1标准曲线）标准曲线）v以以RNA微克数为横坐标，以微克数为横坐标，以A670为纵坐标绘制标准曲线为纵坐标绘制标准曲线编辑pptv（（2）样品的处理：）样品的处理：v称取称取10mg粗提的酵母粗提的酵母RNA加入加入10mL0.04M NaOH溶溶解后转移至解后转移至100mL容量瓶中加水定容容量瓶中加水定容混匀即得样混匀即得样品液品液.v（（3）酵母）酵母RNA含量测定：含量测定：v取试管取试管1支加入支加入2 mL样品液，再加样品液，再加2 mL地衣酚地衣酚-铜试铜试剂沸水加热剂沸水加热25分钟冷却后测定分钟冷却后测定A(用用1号调零号调零) 编辑pptv3、酵母、酵母RNA水解水解v取取100 mg粗提的酵母粗提的酵母RNA于三角瓶中，加入于三角瓶中，加入1.5M硫酸硫酸10mL, 沸水浴加热沸水浴加热10分钟制成水解液，然后进行组份鉴定。

分钟制成水解液，然后进行组份鉴定v4、、RNA组份鉴定组份鉴定v（（1）嘌呤碱：）嘌呤碱：v取水解液取水解液1mL于试管中滴加入于试管中滴加入2mL浓氨水然后加入浓氨水然后加入10滴滴0.1M硝酸银溶液，观察有无白色嘌呤碱银化合物沉淀硝酸银溶液，观察有无白色嘌呤碱银化合物沉淀v（（2）核糖：）核糖：v取水解液取水解液1mL于试管中加入三氯化铁浓盐酸溶液于试管中加入三氯化铁浓盐酸溶液2mL和苔黑和苔黑酚乙醇溶液酚乙醇溶液4滴放沸水浴中滴放沸水浴中10min注意观察核糖是否变注意观察核糖是否变成绿色v（（3）磷酸：）磷酸：v取水解液取水解液3mL于试管中加于试管中加5滴浓硝酸酸化，再加入滴浓硝酸酸化，再加入20滴钼酸滴钼酸铵溶液在沸水浴上加热，观察有无黄色磷钼酸铵沉淀产生铵溶液在沸水浴上加热，观察有无黄色磷钼酸铵沉淀产生编辑pptv四、结果处理四、结果处理v1. 酵母酵母RNA得率（得率（%））=（（W2-W1））*100∕Wv      其中其中  W-干酵母粉重量（克）干酵母粉重量（克）v2.  粗提的酵母粗提的酵母RNA含量（含量（%））=m*V1*100∕V2*W/v其中其中  W/-酵母酵母RNA重量（重量（µg））v     m-从标准曲线上查得从标准曲线上查得RNA的微克数的微克数v     V1-100 mLv     V2-2 mL编辑ppt实验八　赖氨酸含量测定实验八　赖氨酸含量测定一、实验目的一、实验目的掌握谷物中赖氨酸含量的测定方法及原理。

掌握谷物中赖氨酸含量的测定方法及原理编辑ppt二、实验原理二、实验原理v蛋白质中赖氨酸的含量是谷物品质的主要指标之一由于动物及蛋白质中赖氨酸的含量是谷物品质的主要指标之一由于动物及人类不能合成，须从食物中得以补充，为此培育高含量赖氨酸的人类不能合成，须从食物中得以补充，为此培育高含量赖氨酸的谷物，对于提高营养价值有重要意义本实验分别用茚三酮溶液谷物，对于提高营养价值有重要意义本实验分别用茚三酮溶液显色法和染料结合法，测定显色法和染料结合法，测定小麦小麦种子中赖氨酸含量种子中赖氨酸含量v谷物蛋白中赖氨酸残基有自由的谷物蛋白中赖氨酸残基有自由的ε－－NH3与茚三酮试剂可发生颜与茚三酮试剂可发生颜色反应，生成紫红色物质，其颜色深浅与赖氨酸残基的数目成正色反应，生成紫红色物质，其颜色深浅与赖氨酸残基的数目成正相关，而其它氨基酸没有自由氨基，不能发生这一反应选用碳相关，而其它氨基酸没有自由氨基，不能发生这一反应选用碳原子数目与赖氨酸相同的亮氨酸，配成标准溶液，做出标准曲线，原子数目与赖氨酸相同的亮氨酸，配成标准溶液，做出标准曲线，可用以测定谷物蛋白内赖氨酸的含量可用以测定谷物蛋白内赖氨酸的含量。

编辑ppt三、实验仪器、试剂三、实验仪器、试剂 1．．主要主要仪器：仪器：v（（1））分光光度计分光光度计v（（2）离心机）离心机v（（3）电子天平）电子天平2．试剂：．试剂：v（（1）茚三酮试剂）茚三酮试剂v（（2））2％碳酸钠溶液％碳酸钠溶液v（（3））4％碳酸钠溶液％碳酸钠溶液v（（4））0.1mg/mL亮氨酸溶液亮氨酸溶液v（（5））95%乙醇乙醇编辑ppt四、实验步骤四、实验步骤v1.标准曲线的制作（每2组4人做1标准曲线） 以亮氨酸的微克数为横坐标，以以亮氨酸的微克数为横坐标，以A515纵坐标绘制标准曲线纵坐标绘制标准曲线编辑pptv 　　2、样品的处理与测定：在电子天平上称取小麦、样品的处理与测定：在电子天平上称取小麦粉粉10mg于具塞试管底部于具塞试管底部→加加1mL 2% 碳酸钠于碳酸钠于80℃℃水浴中保温提取水浴中保温提取10min→加加2mL茚三铜试剂茚三铜试剂80℃℃水浴中保温水浴中保温30min后冷却至室温后冷却至室温→加加5mL 95%乙醇和乙醇和5mL蒸馏水充分混匀后转移至离心管中蒸馏水充分混匀后转移至离心管中3000转转/分分 离心离心3min（离心前必须平衡）（离心前必须平衡）→取上清液测取上清液测A515（用（用1#管调零管调零)编辑ppt五、结果计算五、结果计算v赖氨酸含量（赖氨酸含量（%）＝）＝v式中：式中：m：标准曲线上查出的亮氨酸的量；：标准曲线上查出的亮氨酸的量； v1.11=Mlys/MleuvW：为样品的干重（：为样品的干重（mg）。

vB=0.05   小麦中游离氨基酸含量小麦中游离氨基酸含量编辑ppt实验九、凝胶层析法分离蛋白质实验九、凝胶层析法分离蛋白质一、实验目的一、实验目的v学习凝胶层析法测定蛋白质分子量的原理，了解凝胶层析法的学习凝胶层析法测定蛋白质分子量的原理，了解凝胶层析法的操作方法操作方法编辑ppt　　二、实验原理二、实验原理          凝胶层析又称分子筛层析，是利用有一定孔径凝胶层析又称分子筛层析，是利用有一定孔径范围的多孔凝胶，对混合物中各组分按分子大小进范围的多孔凝胶，对混合物中各组分按分子大小进行分离的层析技术把含有不同大小分子的混合液，行分离的层析技术把含有不同大小分子的混合液，铺加在胶面上，让它流过凝胶柱由于凝胶具有网铺加在胶面上，让它流过凝胶柱由于凝胶具有网络结构，当混合液通过凝胶颗粒缝隙中时，溶液中络结构，当混合液通过凝胶颗粒缝隙中时，溶液中的溶质凡是比网孔小的分子，都能自由进入颗粒内的溶质凡是比网孔小的分子，都能自由进入颗粒内部而受阻滞部而受阻滞,流速缓慢流速缓慢,流程长而后被洗脱；而比网流程长而后被洗脱；而比网孔大的分子则不能进入凝胶网孔而沿凝胶颗粒间的孔大的分子则不能进入凝胶网孔而沿凝胶颗粒间的空隙先被洗脱空隙先被洗脱(阻力小阻力小,流程短流程短,流速大流速大)。

因此，在洗因此，在洗脱小分子物质后流出（洗脱体积大），从而达到分脱小分子物质后流出（洗脱体积大），从而达到分离的目的离的目的编辑ppt三、实验仪器、试剂三、实验仪器、试剂1.主要仪器：主要仪器：（（1））凝胶凝胶层析仪层析仪（（2）电子天平）电子天平（（3）层析柱）层析柱2.试剂：试剂：（（1））Sephadex G—100（（2）牛血清白蛋白）牛血清白蛋白（（3）细胞色素）细胞色素C（（4）血红蛋白）血红蛋白（（5）核糖核酸酶）核糖核酸酶编辑pptv 四、操作步骤四、操作步骤v 1、凝胶的选择与处理：称取凝胶干粉加过量水浸泡过夜，弃去上层细、凝胶的选择与处理：称取凝胶干粉加过量水浸泡过夜，弃去上层细                  小颗粒混匀后装柱小颗粒混匀后装柱v2. 装柱：将柱子垂直固定在铁架上，先向装柱：将柱子垂直固定在铁架上，先向柱柱内加入四分之一柱长水，再内加入四分之一柱长水，再将凝胶倒入柱内，打开下端开口，继续灌入凝胶，直至床面距上端将凝胶倒入柱内，打开下端开口，继续灌入凝胶，直至床面距上端5cm左右，观察柱内凝胶是否均匀，有无气泡及断层出现左右，观察柱内凝胶是否均匀，有无气泡及断层出现。

v3. 平衡：柱子装好后放置平衡：柱子装好后放置20min，用洗脱液平衡柱子直至床面不再下降，用洗脱液平衡柱子直至床面不再下降为止，用蓝色葡聚糖为止，用蓝色葡聚糖2000检测柱子是否均匀检测柱子是否均匀v4. 上样与洗脱：加样前检查床面是否平整，若不平衡用玻璃棒搅拌凝胶上样与洗脱：加样前检查床面是否平整，若不平衡用玻璃棒搅拌凝胶使其自然下沉，在胶面上放置圆形滤纸片防止加样时冲击床面，用胶头使其自然下沉，在胶面上放置圆形滤纸片防止加样时冲击床面，用胶头滴管滴管小心小心吸去上层多余水，然后慢慢滴加吸去上层多余水，然后慢慢滴加10d牛血清蛋白样品（每牛血清蛋白样品（每班班加加1次样），待样品进入凝胶后，向床面滴加次样），待样品进入凝胶后，向床面滴加2cm高度水防止干胶，拧紧高度水防止干胶，拧紧螺丝螺丝（用手固定上边螺丝，旋紧柱子上的螺丝以防瓶底导管逸出）（用手固定上边螺丝，旋紧柱子上的螺丝以防瓶底导管逸出）；打；打开开层析柜后面的总电源，标记层析柜后面的总电源，标记初始笔尖位置初始笔尖位置及最初收集管位置及最初收集管位置，直至峰，直至峰值出现记录笔移动距离值出现记录笔移动距离（（L），测量连续），测量连续3管体积（管体积（V））。

v5、仪器参数设置及调整：、仪器参数设置及调整：①①紫外检测仪：当档位置于紫外检测仪：当档位置于100%T时，调光时，调光量至数显为量至数显为100当档位置于当档位置于0.5A时时 调调A数显为数显为0 ②②记录仪：设置记录仪：设置V纸速纸速=2cm/h ③③部分收集器：设置每部分收集器：设置每8min收集收集1管，调恒流泵流速使每管收管，调恒流泵流速使每管收集液体为集液体为3.2mL 即即V流速流速=0.4mL/min编辑ppt五、结果计算五、结果计算    1、、计算洗脱体积计算洗脱体积   Ve=L×V流速流速/V纸速纸速v2、、以以蛋白质分子量的对数值（蛋白质分子量的对数值（logMr）为纵坐标、）为纵坐标、 Ve为横为横坐标，作出分子量标准曲线坐标，作出分子量标准曲线v3、样品完全按照标准曲线的条件操作，根据洗脱体积，从、样品完全按照标准曲线的条件操作，根据洗脱体积，从分子量标准曲线查出相应的分子量分子量标准曲线查出相应的分子量v注意事项：注意事项：v1.层析柱上方要留有少量液体，避免使凝胶暴露于空气中层析柱上方要留有少量液体，避免使凝胶暴露于空气中v2. 凝胶过滤上样时，使样品沿管壁缓缓流下，勿冲破胶面凝胶过滤上样时，使样品沿管壁缓缓流下，勿冲破胶面编辑ppt实验十：酵母蔗糖酶的提取及部分纯化一、实验目的：一、实验目的：    学习酶的提取和纯化方法，并为后续实验提供一定量的蔗糖酶。

学习酶的提取和纯化方法，并为后续实验提供一定量的蔗糖酶二、实验原理：二、实验原理：　　　　 蔗糖酶（蔗糖酶（invertase）（）（-D-呋喃果糖苷果糖水解（呋喃果糖苷果糖水解（fructofuranoside fructohydrolase）（）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的）特异地催化非还原糖中的—呋喃果呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，糖苷键水解，具有相对专一性不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖        本实验提取啤酒酵母中的蔗糖酶该酶以两种形式存在于酵母细胞膜本实验提取啤酒酵母中的蔗糖酶该酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶（的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶（external yeast invertase））, 其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50% 糖成分糖成分的糖蛋白在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶（的糖蛋白在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶（internal yeast invertase），含有少量的糖。

两种酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，），含有少量的糖两种酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，两种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，两种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser和和Met，它们的分子量也不同，外酶约为，它们的分子量也不同，外酶约为27万万(或或22万，与酵母的来万，与酵母的来源有关源有关)，内酶约为，内酶约为13.5万尽管这两种酶在组成上有较大的差别，但其万尽管这两种酶在组成上有较大的差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶，底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的主要是外酶而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的主要是外酶编辑ppt四、操作步骤：四、操作步骤： 1. 提取提取（（1）准备一个冰浴，将研钵稳妥放入冰浴中（两组做一个）准备一个冰浴，将研钵稳妥放入冰浴中（两组做一个）2）取）取5g二氧化硅二氧化硅放入研钵中研细放入研钵中研细3）称取）称取5g干啤酒酵母放入研钵中，量取预冷的甲苯干啤酒酵母放入研钵中，量取预冷的甲苯20mL缓缓慢加入酵母中，边加边研磨成糊状，约需慢加入酵母中，边加边研磨成糊状，约需30分钟，至酵母细胞大部分研碎。

分钟，至酵母细胞大部分研碎  （（4）缓慢加入预冷的）缓慢加入预冷的40mL去离子水，每次加去离子水，每次加2mL左右，边加边研磨左右，边加边研磨30分钟以便将蔗糖酶充分转入水相便将蔗糖酶充分转入水相5）将混合物转入）将混合物转入4个离心管中（每组个离心管中（每组2个），平衡后，个），平衡后，用高速冷冻离心机离心（用高速冷冻离心机离心（4℃℃，，10,000rpm，，10min）如果中间白色的脂肪层厚，）如果中间白色的脂肪层厚，说明研磨效果良好用滴管吸出上层有机相说明研磨效果良好用滴管吸出上层有机相6）用滴管小心地取出脂肪层下面）用滴管小心地取出脂肪层下面的水相，转入另一个清洁的离心管中，两组平衡后，的水相，转入另一个清洁的离心管中，两组平衡后，4℃℃，，10,000rpm，离心，离心10min7）将清液转入量筒，量出体积（）将清液转入量筒，量出体积（“粗级分粗级分I”），取出），取出1.5mL放入小离心放入小离心管中，冷冻保存，备下次实验测定酶活力及蛋白质含量其余部分转入另一清洁管中，冷冻保存，备下次实验测定酶活力及蛋白质含量其余部分转入另一清洁离心管中离心管中 2. 热处理热处理（（1）预先将恒温水浴调到）预先将恒温水浴调到50℃℃，（，（2）用广泛）用广泛pH试纸检查清液（试纸检查清液（“粗级分粗级分I”）的）的pH，，用用1N乙酸将乙酸将pH调至调至5.0。

 （（3）将盛有粗级分）将盛有粗级分I的离心管稳妥地放入水浴中，的离心管稳妥地放入水浴中，50℃℃下保温下保温30分钟，在保温过程中不断轻摇离心管分钟，在保温过程中不断轻摇离心管4）取出离心管，于冰浴中迅速）取出离心管，于冰浴中迅速冷却，平衡后冷却，平衡后4℃℃，，10,000rpm，离心，离心10min5）将上清液转入量筒，量出体）将上清液转入量筒，量出体积（称为积（称为“热级分热级分II”）取出1.5mL放入小离心管中，冷冻保存放入小离心管中，冷冻保存3. 乙醇沉淀乙醇沉淀　　将热级分　　将热级分II转入小烧杯中，放入冰浴中，逐滴加入等体积预冷至－转入小烧杯中，放入冰浴中，逐滴加入等体积预冷至－20℃℃的的95%乙乙醇，同时轻轻搅拌，共需醇，同时轻轻搅拌，共需30分钟，再在冰浴中放置分钟，再在冰浴中放置10分钟，以沉淀完全于分钟，以沉淀完全于4℃℃，，10,000rpm，离心，离心10min，倾去上清，并滴干用，倾去上清，并滴干用3mL，，0.02mol/L，，pH4.9乙酸乙酸缓冲液将沉淀溶解，平均分成两份（称为缓冲液将沉淀溶解，平均分成两份（称为“醇级分醇级分ⅢⅢ”），冷冻保存。

　），冷冻保存　编辑ppt实验十一实验十一:蔗糖酶活力的测定蔗糖酶活力的测定v一、实验目的一、实验目的v    掌握蔗糖酶活性测定方法了解各级分酶的纯化情况掌握蔗糖酶活性测定方法了解各级分酶的纯化情况v二、实验原理二、实验原理v　　为了评价酶的纯化效果，必须测定各级分酶的活性和比　　为了评价酶的纯化效果，必须测定各级分酶的活性和比活性v　　测定蔗糖酶活性的方法有许多种，如费林试剂法、　　测定蔗糖酶活性的方法有许多种，如费林试剂法、Nelson’s试剂法、水杨酸试剂法等，试剂法、水杨酸试剂法等，v本实验使用费林试剂法其原理是在酸性条件下，蔗糖酶催本实验使用费林试剂法其原理是在酸性条件下，蔗糖酶催化蔗糖水解，生成一分子葡萄糖和一分子果糖这些具有还化蔗糖水解，生成一分子葡萄糖和一分子果糖这些具有还原性的糖与碱性铜试剂混合加热后被氧化，二价铜被还原成原性的糖与碱性铜试剂混合加热后被氧化，二价铜被还原成棕红色氧化亚铜沉淀，氧化亚铜与磷钼酸作用，生成蓝色溶棕红色氧化亚铜沉淀，氧化亚铜与磷钼酸作用，生成蓝色溶液，其蓝色深度与还原糖的量成正比，于液，其蓝色深度与还原糖的量成正比，于650nm测定光吸收测定光吸收值。

值编辑pptv三、试剂和器材三、试剂和器材v  （一）试剂：（一）试剂：v　　1. 碱性铜试剂：称碱性铜试剂：称10g无水无水NaCO3，加入，加入100mL去离子水溶解，另称去离子水溶解，另称1.88g酒石酸，用酒石酸，用100mL去离子水溶解，混合二溶液，再加入去离子水溶解，混合二溶液，再加入1.13克结克结晶晶CuSO4，溶解后定容到，溶解后定容到250mLv  2. 磷钼酸试剂：在烧杯内加入钼酸磷钼酸试剂：在烧杯内加入钼酸17.5g，钨酸钠，钨酸钠2.5g，，10% NaOH 100mL, 去离子水去离子水100mL，混合后煮沸约，混合后煮沸约30min（小心不要蒸干），驱（小心不要蒸干），驱去钼酸中存在的氨，直到无氨味为止，冷却后加去钼酸中存在的氨，直到无氨味为止，冷却后加85%磷酸磷酸63mL,混合并混合并稀释到稀释到250mLv  3. 0.25%苯甲酸苯甲酸200mL，配葡萄糖用，防止时间长溶液长菌，也可以，配葡萄糖用，防止时间长溶液长菌，也可以用去离子水代替用去离子水代替v  4. 葡萄糖标准溶液：（葡萄糖标准溶液：（1）贮液：精确称取无水葡萄糖（应在）贮液：精确称取无水葡萄糖（应在105℃℃恒恒重过）重过）0.1802克，以克，以0.25%苯甲酸溶液溶解后，定容到苯甲酸溶液溶解后，定容到100mL容量瓶中容量瓶中（浓度（浓度10mmol/L）。

 （（2）操作溶液：用移液管取贮液）操作溶液：用移液管取贮液10mL，置于，置于50mL容量瓶中，以用容量瓶中，以用0.25%苯甲酸或去离子水稀释至刻度（浓度为苯甲酸或去离子水稀释至刻度（浓度为2mmol/L）v  5. 0.2mol/L蔗糖溶液蔗糖溶液50mL，分装后冰冻保存，因蔗糖极易水解，用时，分装后冰冻保存，因蔗糖极易水解，用时取出一管化冻后摇匀取出一管化冻后摇匀v  6. 0.2mol/L乙酸缓冲液，乙酸缓冲液，pH4.9，，200mLv  （二）器材：（二）器材：v　　1. 试管试管20支，试管架支，试管架1个个  2. 秒表秒表1块，或用手表块，或用手表 3. 移液管：移液管：0.1、、0.2、、2.0、、5.0mL  4. 水浴锅水浴锅  5. 电炉电炉  6. 橡皮筋橡皮筋  7. 保鲜膜保鲜膜编辑pptv四、操作方法四、操作方法v      级分级分ⅠⅠ、、ⅡⅡ、、ⅢⅢ酶活力的测定：酶活力的测定：v　　1. 用用蒸馏水蒸馏水稀释各级分酶液（稀释各级分酶液（1,000倍可v在实验在实验十二十二稀释液的基础上进一步稀释）稀释液的基础上进一步稀释）v  2. 按下页按下页“表表1”的顺序在试管中加入各试剂的顺序在试管中加入各试剂（（mL），进行测定。

进行测定编辑pptv 表表 1   级分级分ⅠⅠ、、II、、III的酶活力测定的酶活力测定编辑pptv五、结果计算五、结果计算v1.￿稀释后酶液的活力（按还原糖计算）：稀释后酶液的活力（按还原糖计算）：v式中：式中：￿A650：第：第2~10管所测管所测A650￿v￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿A’650：第：第12管所测管所测A650￿￿v￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿0.2：第：第12管葡萄糖取样量管葡萄糖取样量￿￿v￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿2：标准葡萄糖浓度（：标准葡萄糖浓度（2mmol/L￿=￿2μmol/mL））￿￿v￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿10：反应：反应10min￿￿￿￿v￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿B：每管加入酶液的毫升数每管加入酶液的毫升数v　　　　￿￿￿￿￿2.￿原始酶液的酶活力原始酶液的酶活力￿E￿=￿(平均平均E’/2)×稀释倍数（稀释倍数（Units￿/￿mL原始组分）原始组分）v［注］：一个酶活力单位［注］：一个酶活力单位Units，是在给定的实验条件下，每分钟能催化，是在给定的实验条件下，每分钟能催化1mole蔗糖水解所需的酶量，而水解蔗糖水解所需的酶量，而水解1mole蔗糖则生成蔗糖则生成2moles还原糖，计算时请注意。

还原糖，计算时请注意v　　　　v3.酶纯化效果分析：酶纯化效果分析：￿编辑ppt   注：蛋白含量注：蛋白含量=蛋白浓度蛋白浓度×总体积总体积                  总酶活总酶活=酶活酶活×校正体积校正体积                  比活力比活力=总酶活总酶活/总总蛋白含量蛋白含量                纯化倍数纯化倍数=比活力比活力之比之比 回收率回收率=总酶活总酶活之比之比     　为了测定和计算下面纯化表中的各项数据，对各个级分都必须取样，每取一　为了测定和计算下面纯化表中的各项数据，对各个级分都必须取样，每取一次样，对于下一级分来说会损失一部分量，因而要对下一个级分的体积进行校次样，对于下一级分来说会损失一部分量，因而要对下一个级分的体积进行校正，以使回收率的计算不致受到不利的影响正，以使回收率的计算不致受到不利的影响表表2  酶的纯化表酶的纯化表编辑ppt表表3  记录体积的校正记录体积的校正编辑ppt实验十二实验十二￿Bradford法测定蛋白质含量法测定蛋白质含量v一、实验目的一、实验目的v    了解各种蛋白质含量测定方法的优缺点，掌握了解各种蛋白质含量测定方法的优缺点，掌握Bradford法测定蛋白质法测定蛋白质含量的原理及方法。

含量的原理及方法v二、原理二、原理v　　考马斯亮兰　　考马斯亮兰G-250染料在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大染料在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（吸收峰的位置（max）由）由465nm变为变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香为蓝色染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合在族氨基酸残基相结合在595nm下测定的吸光度值下测定的吸光度值A595与蛋白质浓度成与蛋白质浓度成正比v    Bradford法的突出优点是：（法的突出优点是：（1）灵敏度高，据估计比）灵敏度高，据估计比Lowry法约高法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达四倍，其最低蛋白质检测量可达1g/mL2）测定快速、简便，只需加）测定快速、简便，只需加一种试剂完成一个样品的测定，只需要一种试剂完成一个样品的测定，只需要5分钟左右分钟左右3）干扰物质少干扰物质少    编辑ppt›三、试剂与器材三、试剂与器材›    1. 试剂：试剂：›（（1））0.1mg/mL标准蛋白质溶液标准蛋白质溶液›（（2）染料试剂：）染料试剂：0.1mg∕mL 考马斯亮兰考马斯亮兰G-250›    2. 器材：器材：›（（1）可见光分光光度计）可见光分光光度计 ›（（2））离心机离心机编辑ppt（（3）加完试剂后混匀。

加完试剂后混匀5分钟后，以一号管为空白测定各管的分钟后，以一号管为空白测定各管的A5954）用标准蛋白）用标准蛋白含含量（量（mg）为横坐标，用吸光度值）为横坐标，用吸光度值A595为纵坐标作图，即得为纵坐标作图，即得到一条标准曲线由此标准曲线，根据测出的未知样品的到一条标准曲线由此标准曲线，根据测出的未知样品的A595值，即可查出值，即可查出未知样品的蛋白质含量未知样品的蛋白质含量0.05mg牛血清蛋白牛血清蛋白/mL溶液的溶液的A595约为约为0.29四、操作方法四、操作方法（（1）取级分）取级分I、级分、级分II、级分、级分III各各0.2mL，分别，分别用蒸馏水用蒸馏水稀释稀释50倍2）取）取13支试管，按下表编号并添加各种试剂（支试管，按下表编号并添加各种试剂（mL）编辑ppt。