硅胶柱层析分离的实验原理、方法及技巧.doc

硅胶柱层析别离的实验原理、方法与技巧 _k_J{*5&,_一、硅胶柱层析原理 J_"z8olV 　　硅胶层析法的别离原理是根据物质在硅胶上的吸附力不同而得到别离，一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附，整个层析过程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸过程S_ _|B7HS5 　　硅胶柱层析流动相 !]"T`^5,Y_ 　　极性小的用乙酸乙酯：石油醚系统；极性较大的用甲醇：氯仿系统；极性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系统；拖尾可以参加少量氨水或冰醋酸 vm Hf$rq_ 　　硅胶柱层析惯用方法 zIlQqyOQ8_ 1.称量200-300目硅胶，称30-70倍于上样量；如果极难分，也可以用100倍量的硅胶H干硅胶的视密度在0.4左右，所以要称40g硅胶，用烧杯量100ml也可以 ,H_|V__\\ 2.搅成匀浆参加干硅胶体积一倍的溶剂用玻璃棒充分搅拌如果洗脱剂是石油醚/乙酸乙酯/丙酮体系，就用石油醚拌；如果洗脱剂是氯仿/醇体系，就用氯仿拌如果不能搅成匀浆，说明溶剂中含水量太大，尤其是乙酸乙酯/丙酮，如果不与水配伍走分配色谱的话，必须预先用无水硫酸钠久置枯燥氯仿用无水氯化钙枯燥，以除去1%的醇。

如果样品对酸敏感，不能用氯仿体系过柱 ^c/.D*J_[I 3.装柱将柱底用棉花塞紧，不必用海沙，参加约1/3体积石油醚〔氯仿〕，装上蓄液球，翻开柱下活塞，将匀浆一次倾入蓄液球随着沉降，会有一些硅胶沾在蓄液球，用石油醚〔氯仿〕将其冲入柱中 M,7v}[Tbl 4.压实沉降完成后，参加更多的石油醚，用双联球或气泵加压，直至流速恒定柱床约被压缩至9/10体积无论走常压柱或加压柱，都应进展这一步，可使别离度提高很多，且可以防止过柱时由于柱床萎缩产生开裂 _z;Kyg_}__ 5.上样干法湿法都可以海沙是没必要的上样后，参加一些洗脱剂，再将一团脱脂棉塞至接近硅胶外表然后就可以放心地参加大量洗脱剂，而不会冲坏硅胶外表 `~gyq>I_k2 6.过柱和收集柱层析实际上是在扩散和别离之间的权衡太低的洗脱强度并不好，推荐用梯度洗脱收集的例子：10mg上样量，1g硅胶H，0.5ml收一馏分；1-2g上样量，50g硅胶〔200-300目〕，20-50ml收一馏分 _8"Z_K^+]y 7.检测要更多地使用专用喷显剂，如果仅用紫外灯，会损失较多产品，紫外的灵敏度一般比喷显剂底1-2个数量级 `Up_3p_24_ 8.送谱。

收集的产品旋干，在送谱前通常需要重结晶如果样品太少或为液体，可过一小凝胶柱，作为送谱前的最后纯化手段可除去氢谱1.5ppm左右所谓的"硅胶〞峰 _{Z$Aw4a"d _N U\_B_ 二、柱层析别离的实验方法和技巧 _k_J{*5&,_ )]__"sb 常说的过柱子应该叫柱层析别离，也叫柱色谱我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱由于柱分的经历成分太多，所以下面我就几年来过柱的体会写些心得，希望能有所帮助h>q__& *4- YG$Y4h" " 一：柱子可以分为：加压，常压，减压 ' 4_ftclzL 压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数所以其他条件一样的时候，常压柱是效率最高的，但是时间也最长，比方天然化合物的别离，一个柱子几个月也是有的C_aPF 减压柱能够减少硅胶的使用量，感觉能够节省一半甚至更多，但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发〔有时在柱子外面有水汽凝结〕，以及有些比拟易分解的东西可能得不到，而且还必须同时使用水泵抽气〔很大的噪音，而且时间长〕以前曾经大量的过减压柱，对它有比拟深厚的感情，但是自从尝试了加压后，就几乎再也没动过减压的念头了。

n~;[=o"_5 加压柱是一种比拟好的方法，与常压柱类似，只不过外加压力使淋洗剂走的快些压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵〔给鱼缸供气的就行〕特别是在容易分解的样品的别离中适用压力不可过大，不然溶剂走的太快就会减低别离效果个人觉得加压柱在普通的有机化合物的别离中是比拟适用的 +7.\>Ucq` Rq_|_7$O5 二：关于柱子的尺寸 i__l|e5TD^ 应该是粗长的最好柱子长了，相应的塔板数就高柱子粗了，上样后样品的原点就小〔反映在柱子上就是样品层比拟薄〕，这样相对的减小了别离的难度试想如果柱子十厘米，而样品就有二厘米，则别离的难度可想而知，恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了而如果样品层只有0.5厘米，则各组分就比拟容易得到完全别离了当然采用粗大的柱子要牺牲比拟多的硅胶和溶剂了，不过这些本钱相对于产品来说也许就不算什么了〔有些不环保的说，不过溶剂回收重蒸后也就减小了局部浪费〕I

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l1{\|.,_ `1 A,s*fa 四：关于湿法、干法上样 Pw+_PBIGn4 湿法省事，一般用淋洗剂溶解样品，也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等，但溶剂越少越好，不然溶剂就成了淋洗剂了很多样品在上柱前是粘乎乎的，一般没关系可是有的上样后在硅胶上又会析出，这一般都是比拟大量的样品才会出现，是因为硅胶对样品的吸附饱和，而样品本身又是比拟好的固体才会发生，这就应该先重结晶，得到大局部的产品后再柱分，如果不能重结晶，那就不管它了，直接过就是了，样品随着淋洗剂流动会溶解的VW&EdrR,S 有些样品溶解性差，能溶解的溶剂又不能上柱〔比方DMF,DMSO等，会随着溶剂一起走，显色是一个很长的脱尾〕，这时就必须用干法上柱了样品和硅胶的量有一种说法是1：1，我觉得是越少越好，但是要保证在旋干后，不能看到明显的固体颗粒〔那说明有的样品没有吸附在硅胶上〕 _[`_J9__1= OEi u,Y|l 五：溶剂的选择2_7J_!oin$ 当然是最廉价，最平安，最环保的了所以大多项选择用石油醚，乙酸乙酯文献中有写用正己烷的，太贵了，除非特别需要不要用不然银子哗哗的，流的比淋洗剂还快，不过因为极性很小，有时还是非它不可。

乙醚也可以用，但是就是容易睡觉，注意保持清醒别让溶剂流干了，那样柱子也就不爽了二氯甲烷也有用的，但是要知道，它和硅胶的吸附是一个放热过程，所以夏天的时候经常会在柱子里产生气泡，天气冷的时候会好一些甲醇据说能溶解局部的硅胶，所以产品如果想过元素分析的话要留神，应该经过后继处理，比方说重结晶等其他的溶剂用的相对较少，要依个人的不同需要选择了RI__SDjU3 由于*些原因，用到的淋洗剂多是大包装的〔廉价嘛〕，我们这里是用10升或25升的塑料桶装的，就要注意这些工业品的纯度是较低的经常能够从送来的大桶底部看见有色的杂质，其他的杂质就可想而知了，所以在比拟严格的柱分时就要对溶剂重蒸当然过原料时就可以免去这一步了，反正下面还有提纯的方法1aAY_7Dm_& 另外溶剂在过柱子后最好也回收使用，一方面环保，另一方面也能节省局部经费，缺点是要消耗一定的人工这里要注意的是，一般在过柱同时进展的是减压旋蒸，石油醚和乙酸乙酯的比例由于挥发度的不同会导致极性的变化，一般会使得极性变大，在梯度淋洗时比拟适宜，正好极性越来越大了在过完柱子后，溶剂最后回收要采用常压，因为在减压旋蒸时会有局部低沸点的杂质一起出来，常压时就会减少这种现象，如果杂质和你下面要过的样品有反响那就惨了。

ml,FBBGq|- S_y)Q_[_A 六：关于操作问题 f`_

不要认为在板上爬高了分的比拟开，过柱子就用那种极性，如果rf在0.6，即使相差0.2也不容易在柱子上分开，因为柱子是一个屡次爬板的状态，可以通过公式的比拟：0.6/0.8一次的别离度，肯定不如〔0.2/0.3〕的三次方或四次方大 Qz_"+M+~%& "T$L_J_1E 4、样品的收集#iKPp0_`K* 用硅胶作固定相过柱子的原理是一个吸附与解吸的平衡所以如果样品与硅胶的吸附比拟强的话，就不容易流出这样就会发生，后面的点先出，而前面的点后出这时可以采用氧化铝作固定相另外，收集的试管大小要以样品量而定，特别是小量样品，如果用大试管，可能一根就收到了三个样品，wuwu如果都用小试管那工作量又太大7W'&_v+__\ )K8 ^_}L, 5、最后的处理Q_45gC28_* 柱分后的产品，由于使用了大量的溶剂，其中的杂质也会累积到产品中，所以如果想送分析，最好用少量的溶剂洗涤一下，因为大局部的杂质是溶在溶剂里的，一洗根本就没了，必要时进展重结晶H_u9nJ H&_8~"h6n_ 另外，再过柱的时候，有时会出现气泡，一是和使用的溶剂有关，如果是易挥发的溶剂，如乙醚、二氯甲烷等，在室温稍高的情况下，很容易出现这种现象，因此，在室温高的时候，可以选择沸点较高，挥发相对小的溶剂。

还有，使用混合溶剂时，使用的两种溶剂的沸点应该相差不大，如：乙酸乙酯和石油醚(60~90),而乙醚却要选择30－60的石油醚二是：不管是用带砂板的还是塞棉花的，在装柱之前，都要将空气用加压的方法将空气排干，这样就可防止柱中有空气！. 。