仔猪粪便中乳酸菌的分离、鉴定及抗逆性选育-重庆市畜牧科学院.doc

仔猪粪便中乳酸菌的分离、鉴定及其抑菌特性的研究张素辉，曹国文，徐登峰，王孝友，蒋安(重庆市畜牧科学院 荣昌402460)摘要从健康仔猪新鲜粪便中分离到3株乳酸菌，对其进行了属和种的生化鉴定，结果为，菌株La与Lt均为嗜酸乳杆 菌(Lactobacillus acidophilus), Ls为乳酸乳杆菌(LacfobaciHus laclis)对分离的三株乳酸菌的代谢产物进行了体外 抑菌试验研究，结果表明，3株菌乳酸菌代谢产物对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡篇球菌都有较明显的抑制作用； 对金黄色葡荷球菌的抑菌效果最好，沙门氏菌次之，对大肠杆菌的抑菌效果相对较弱关键词：乳酸菌；分离鉴定；抑菌特性Isolation-identitication and bacteriostasis-bacteriostasis of lactobacillus from piglet s diachoremaZhang suhui, Cao Guowen, Qiu Jinjie, Xu Dengfeng, Wang Xiaoyou, Jiang-an(ChongQing Academy of Animal Sciences ChongQing RongChang)Abstract Isolated 3 strains lactobacillus from piglets fresh feces and identified its genus and strain,, results are: the Ls strain is Lactobacillus lactis,由e La and Lt strains are Lactobacillus acidophilus. And carried the metabolic product of three strains in the study of inhibition activity. These experiments proved that, all the Lactobacillus metabolite had apparent inhibition to Colibacillus. Salmonella and Staphylococcus aureus, had the most Bacteriostasis result to Staphylococcus aureus. Salmonella was next to, and the effect with Colibacillus was more feeble.Key words lactobacillus； isolation and identification ； inhibition-activity仔猪腹泻，是引起起仔猪生长受阻和死亡的重要原因之一，一直是困扰养猪业发展的难题。

据 资料统计，我国仔猪死亡率一般波动在15-25%之间，2周龄以内死亡率为26%, 2.4周龄的死亡率为 16%,断奶前后因腹泻而导致的死亡占总死亡率的49.11%l,,o以前常采用在断奶仔猪饲粮中添加抗生 素的办法来控制腹泻，但抗生素在抑制致病性微生物的同时，也破坏了动物体内微生物菌群的平衡, 增加了消化道疾病的发生C同时病原体的耐药性问题越来越严重，部分抗菌药物在畜产品中的残留 等对人类健康构成极大威胁研究和开发无毒、无副和无残留的生物药品已成为热点课题，近年来, 微生态制剂越来越受到众多人士的青睐，微生态调节剂是根据微生态学原理，调整微生态平衡的制 剂微生态疗法是根据微生态学原理，用微生态制剂扶持和恢复肠道菌群的平衡以达到预防腹泻的 目的1998年AAFCO年鉴公布了43种可用作益生素的菌种，其中半数以上是乳酸菌(Lactic acid baciteria)[2]o乳酸菌在益生菌制剂的研究和生产中扮演着重要的角色本研究的目的是从健康仔猪的 新鲜粪便中分离出在体外具有广谱抑菌杀菌效果的乳酸杆菌菌株，从而为开发应用于防治仔猪腹泻 疾性病的微生态制剂提供理论依据和菌种保证作者简介：张素辉(1980-),女，研究实习员。

从事动物微生态制剂与新兽药的研究1材料与方法1.1材料1.1.1样品健康乳猪新鲜粪便，采自多个规模化养猪场1.1.2培养基增菌及分离培养基：改良MRS培养基微量生化鉴定管：购自杭州微生物试剂有限公司1.2方法1.2.1菌株的分离在改良MRS液体培养基中加入适量的新鲜乳猪粪便，富集培养24小时•后，用接种环取培养液 划线接种于改良MRS琼脂平皿，37笆有氧培养48-72h,挑取形态及颜色各异的菌落分别划线接种作 纯培养，并进行镜检观察分离细笛的染色及形态特征1.2.2分离菌的鉴定挑取平板上纯培养的革兰氏阳性无芽胞杆菌：作硝酸盐还原试验，明胶液化试验，过氧化氢酶 试验，靛基质试验和硫化氢试验；作七叶背、纤维二糖、麦芽糖、甘露醇、水杨甘、山梨醇和蔗糖 发酵试验1.2.3乳酸菌对常见肠道致病留的抑gj试验乳酸菌新鲜培养液，按2%(v/v)接种于MRS液体培养基中，静置培养18-24h,取适量培养液， 5000rpm,离心30min,吸取上清液备用临床分离保存的大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌经活化后，接种于普通肉汤中培养12h, 用灭菌吸管分别吸取各菌液培养物0.5ml于普通营养平皿中，用L棒均匀涂布，待琼脂表面水分干燥 后，在平板表而放置灭菌的牛津杯，取制备的乳酸菌上清液于牛津杯内测定其对常见肠道病原菌(大 肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌)的抑菌活性，置37E培养10h,观察并测定抑菌圈的大小。

同时设立相应代谢产物pH值相同的MRS液体培养基作对照判定标准为：抑菌圈直径4 mm判定为不敏感：抑菌圈5-10 mm判定为低度敏感抑菌圈直径 11-15 mm判定为中度敏感；抑1W圈直径大于15mm判定为高度敏感⑶2结果2.1本试验分离得到3株乳酸菌，编号分别为La、Ls、Lt,其菌落特征、菌体形态及染色特征见表11乳酸菌菌落特征、菌体形态及革兰氏染色结果Table 1 Characteristics of colonies and results of Gstaining cells of lactic acid bacteria菌株Strains菌落特征Characteristics of colonies革兰氏染色Graining菌体形态Morphology of bacteiaLa微白色，露滴大小，圆形,微凸， 表面粗糙，边缘不整齐G+两端钝圆，中等大，无芽泡杆菌；MRS同体培养基上培 养物呈散在排列；MRS肉汤培养物呈单个散在排列Ls微白色，露滴样大小，圆形,隆起， 表面光滑，边缘不整齐G+两端钝圆，无芽地小杆菌；MRS固体培养基上培养物呈 散在或短链状排列：MRS肉汤培养物成短链状排列Lt微白色，露滴大小，圆形,隆起， 表面粗糙，边缘不整齐G+两端钝圆，中等大，无芽弛杆菌；MRS固体培养基上培养物呈散在排列；MRS肉汤培养物呈单个散在排列2.2各菌株的鉴定根据革兰氏染色镜检可■知，La、Ls、Lt菌为革兰氏阳性的无芽泡杆菌。

生化实验表明，它们均 不能利用硝酸盐，过氧化氢酶试验和靛基质试验阴性，不液化明胶，不产生硫化氢依据这些菌株 糖发酵试验的结果(见表2),参见《伯杰细菌鉴定手册》(第八版)叫，最终鉴定为：菌株La为嗜 酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus),幽株 Ls 为乳酸乳杆幽(Lactobacillus lactis),幽株 Lt 为嗜酸 乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)表2乳酸杆菌属种的碳水化合物反应Table! Carbohydrate-reaction of species in cillobacterium菌株七叶首纤维二糖麦芽糖甘露隔水杨首山梨醇蔗糖La—+—++Ls+++—+——Lt++++—+注：“ + ”表示90%或90%以上的菌株为阳性反应；“一”表示大多数菌株(90%或以上)为阴性反应；“土”表示有 些菌株为阴性，其他菌株为阳性Note: 44+^demonstrates 90% or more than 90% strains which are positive reaction; ^demonstrates strains which arenegative reaction; "土"demonstrates some of strains arc positive reactions,the other arc negative reaction.2.3乳酸菌代谢产物对常见肠道致病菌的抑菌试验结果由表3可以看出，3株菌乳酸曲•代谢产物对3株病原指示菌都有较强的抑制作用，所有菌株对 金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好，抑菌圈直径在18.23mm之间，各菌株抑菌圈直径由大到小依次为 Ls、Lt、La；对沙门氏菌的抑制效果相对较低，抑菌圈直径在14-17mm之间，各菌株抑菌圈直径由 大到小依次为Ls、La和Lt；对大肠杆菌抑菌圈在15-19mm之间，各菌株抑菌圈直径由大到小依次 为 Ls、La 和 Lt。

比较La、Ls、Lt菌株对沙门氏菌抑菌效果发现，Ls菌株代谢产物的抑制效果最明显，其抑菌圈直径极显著大于La、Lt菌株(pv0.01)；La菌株对沙门氏菌的抑制作用高于Lt菌株，差异显著(pvO.O5)La、Ls、Lt菌株对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌效果均存在极显著差异(p<0.01)o表3不同乳酸菌菌株代谢产物对沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈宜径(单位:mm) Table3. The bacteriostasis-diameter of the metabolic product of three strains to the Salmonella, Colibacillus.Staphylococcus aureus (unit, mm)沙门氏菌大肠杆菌金黄色葡荷球菌La14.60.16.60. 318. 30. 3Ls16. 50. 2r18. 50. 2r22. 6 0.Lt14. 2 015.80. lc21.50. 5C注：表中的抑菌圈直径以平均值土标准差表示肩标字母不同者表示差异显著，大写字母代表p<0.01,小写字母代 表p<0. 05，无标记或字母相同者表示差异不显著P>0. 05cNote: The bacteriostasis-diameter in the table was denote by "average value tandard deviation". The shoulder noted by different letter expressing notable difference, majuscule represent (p<0.01), minuscule represent (p<0.05), no signs or identical letter indicate the difference is not quiet (P>0.05).3讨论目前，许多报道显示，微生态制剂不但能提高机体的生长性能⑸，而且能降低肠杆菌科细菌在 胃肠道各部位定植水平而影响肠道菌群的微生态平衡⑹，专业人士越来越多地注意到饲喂乳酸菌微 。