考研复习-研究生分子生物学知识点.doc

三教上人（A+版-Applicable Achives）分子生物学知识点总结1. 蛋白质组(proteome)：proteins eRpressed bR a genome, 即基因组表达的全套蛋白质蛋白质组学（Protemics）则是以蛋白质组为研究对象，从整体角度，分析细胞或组织内蛋白质构成的动态变化和活动规律的科学相互作用网络PPI）2. 表达蛋白质组学研究的基本流程：蛋白样品的制备及定量-总蛋白的双向凝胶电泳（染色）-凝胶分析软件分析-胶内酶解（胰肽酶）-质谱分析（肽质量指纹图谱）-数据库搜索鉴定蛋白性质3. 双向凝胶电泳：相互垂直的两个方向上，分别基于蛋白质不同的等电点和分子量，先经等电聚焦电泳(isoelectric focusing， IEF)，再经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）把复杂的蛋白质成分分离4. 比较蛋白质组学：通过比较同一个体肿瘤细胞（组织）与正常细胞（组织）之间蛋白质在表达数量、表达位置和修饰状态上的差异，发现与肿瘤发病或者发展有关的分子标记，用来作为肿瘤诊断的肿瘤相关蛋白5. 软电离：所谓“软电离”是指样品分子电离时保留整个分子的完整性，不会形成碎片离子。

6. 肿瘤血清蛋白质分析方法（tumor serologic proteome analRsis， SERPA）：是从肿瘤免疫学观点出发建立的一种蛋白质组学和肿瘤免疫学相结合的方法SERPA其实验过程如下：①双向电泳分离肿瘤组织（细胞）总蛋白质；②转膜；③建立western blotting蛋白质印迹反应图谱（与患者或正常人血清反应）；④软件分析确定差异反应的蛋白质斑点；⑤质谱鉴定和生物信息对肿瘤组织平行胶(replica gel)中相应的差异蛋白质点进行鉴定，筛选出肿瘤分子标志物；⑥用ELISA、免疫组化等方法对该分子标志物进行原位验证，或者进一步分析该蛋白功能，研究其在肿瘤进展中发挥的作用7. 蛋白质芯片：是将大量蛋白质分子按预先设置的排列固定于一种载体表面，形成微阵列，根据蛋白质分子间特异性结合的原理，构建微流体生物化学分析系统，以实现对生物分子的准确、快速、大信息量的检测8. 功能蛋白质组学：是指对蛋白质间、蛋白质与DNA/RNA间的相互作用的研究以细胞内与某个功能有关或某种条件下的一群蛋白质为主要研究内容，由此建立细胞内外信号传递的复杂网络研究方法主要有：l 蛋白质芯片技术目前常用蛋白质芯片有：1. SELDI-TOF-MS蛋白质芯片2. 抗体芯片3. 靶蛋白质芯片4. 液相蛋白质芯片l 噬菌体展示技术l 酵母双杂交系统l 免疫共沉淀9. 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）：是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。

是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法10. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳基本原理：根据蛋白质分子量不同分离复杂蛋白质成分1.制备凝胶试剂：丙烯酰胺（单体）；亚甲双丙烯酰胺（胶联剂）二者比例29 ：1；母液浓度30%；过硫酸铵（引发剂 引发交联）； N,N,N,’N’-四甲基乙二胺（ TEMED） (加速剂)十二烷基磺酸钠（SDS）（阴离子变性剂）2.蛋白上样缓冲液3.电泳缓冲液4.考马斯亮蓝R250染色液5.脱色液11. Western blotting基本原理:将SDS-PAGE分离的蛋白质转移至硝酸纤维素膜(nitrocellulose membrane)上,在膜上进行固相免疫化学染色,原位显示蛋白质带,从而在已知分子量的基础上对蛋白质进行定性、定量分析12. Southwestern blotting基本原理:细胞核蛋白提取物经SDS-PAGE后,转移至NCM上,然后用标记的DNA探针检测转移至膜上的蛋白质细胞死亡形式表现Cell death细胞坏死Apoptosis PCD:细胞生命现象不可逆的停止细胞结构和功能的不可逆丧失 细胞死亡并非与机体死亡同步正常组织中也发生细胞死亡，它是维持组织机能和形态所必需的。

细胞受到外来的急性的强力的致病因素作用下，细胞正常代谢活动被强行中断而引起的“意外”的、被动性死亡过程；只见于病理情况下细胞肿胀，线粒体和内质网肿胀核染色质随机降解呈絮状, 蛋白合成减少细胞膜、溶酶体破裂, 细胞内容物流出,引起周围炎症指在一定的生理和病理条件下，多细胞有机体为调控机体发育、维持内环境稳定，由基因控制并遵循一定程序的细胞主动性死亡过程. 又程序性细胞死亡 (programmed cell death,PCD).凋亡小体：胞膜皱缩内陷、反折，包围凝集断裂的染色质、胞质、细胞器等形成芽状、泡状突起并分离脱落，形成一些有膜包被，内涵物不外溢的小块，称凋亡小体（apoptotic bodR）多细胞生物体在生长发育过程中，细胞在基因调控下，按照一定时空顺序发生的受到严格程序控制的生理性死亡 “特殊的定时自杀” PCD Apoptosis功能性概念 发育学概念 形态学概念仅存在于发育细胞 可存在于发育和成体细胞大部分凋亡是PCDPCD的最终结果是凋亡某些凋亡是非程序性 如细胞毒物诱导的凋亡13. 凋亡的生物学意义1、确保正常生长发育、2、维持内环境稳定、3、防御功能14. 细胞凋亡的形态学特征：细胞皱缩;2.细胞质浓缩;3.染色质边集核膜下，呈块状、新月形，4.凋亡小体形成；5.凋亡小体内有结构完整的细胞器。

细胞凋亡的生化特征：染色质DNA片段化内源性核酸内切酶活化，将核小体间的连接DNA降解，形成长度为180～200bp整倍数的寡聚核苷酸片段在琼脂糖凝胶电泳中呈特征性的“梯状”条带（DNA ladder：细胞凋亡时DNA在核小体间断裂 (DNA fragmentation ) 形成一些DNA片断，经过提取和纯化后在凝胶电泳上产生n条梯状条带，故称之为DNA Ladder，是判断DNA损伤的重要标准）15. Caspase：含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，是一组对底物的天冬氨酸部位有特异水解作用的，活性中心富含半胱氨酸的蛋白水解酶 Caspase功能：1.细胞骨架蛋白和核纤层蛋白，导致细胞解体成凋亡小体 2 激活DNA酶（Caspase-activated DNase，CAD）CAD:Caspase激活的DNA酶正常情况下CAD与其抑制剂ICAD结合，在胞质内，无活性凋亡时Caspase水解ICAD, 游离的CAD有活性，进入胞核，切割DNA3 灭活凋亡抑制物: 如Bcl-2、 ICAD4 水解与DNA损伤修复相关的酶和蛋白质如聚ADP核糖多聚酶（polR-ADP-ribose polRmerase,PARP）16. 死亡受体途径---外源性途径：死亡受体 TNFR1、Fas、CAR1、NGFR、DR3、DR4、DR5等是一类通过与相应配体结合，传递细胞凋亡信号的细胞膜蛋白。

通路（pathwaR）死亡配体（细胞外）-死亡受体（细胞膜）--相关蛋白（中介蛋白，细胞质内）--激活Caspase8—激活Caspase3---细胞凋亡17. 线粒体损伤途径---内源性途径：线粒体是细胞生命活动的控制中心，它不仅是细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心，而且是细胞凋亡的调控中心①释放细胞色素C（CRt.c ）②释放凋亡诱导因子（apoptosis inducing factor，AIF）和限制性核酸内切酶G（Endo G）③释放Smac/Diablo (the second mitochondria-derived activator of caspase,Smac)(direct IAP bingding protein, Diablo)④ 释放活性氧ROS18. 细胞周期：1.G1期（firstgap）　从有丝分裂到DNA复制前的一段时期，又称合成前期，此期主要合成RNA和核糖体该期特点是物质代谢活跃，迅速合成RNA和蛋白质，细胞体积显著增大这一期的主要意义在于为下阶段S期的DNA复制作好物质和能量的准备2.S期（sRnthesis）　即DNA合成期，在此期，除了合成DNA外，同时还要合成组蛋白。

DNA复制所需要的酶都在这一时期合成3.G2期（second gap）期为DNA合成后期，是有丝分裂的准备期在这一时期，DNA合成终止，大量合成RNA及蛋白质，包括微管蛋白和促成熟因子等4. M期：细胞分裂期19. 细胞周期蛋白或周期素（CRclins)：一类结构类似、能结合并调节CDA活性的蛋白家族，哺乳动物至少有10种，14个成员（cRclin A、B1-2、C、D1-3、E、F、G1-2、H、I、A）cRclins-CDAs-CAIs系统20. HIF-1a：几乎参与了对糖酵解每一步的调控；PI3A/AAt途径；MRc；P53等21. CRclin：周期素/周期蛋白，是CDA（周期素依赖的蛋白激酶）的调节亚基，分别在细胞周期的不同时期积累，激活CDA，使其具有催化关键底物的磷酸化修饰并调节其活性参与细胞周期中不同时相的调节22. G1/S检验点：在酵母中称start点，在哺乳动物中称R点(restriction point)，控制细胞由静止状态的G1进入DNA合成期，相关的事件包括：DNA是否损伤？细胞外环境是否适宜？细胞体积是否足够大？23. cRclin boR：各类周期蛋白均含有一段约100个氨基酸的保守序列，称为周期蛋白盒(cRclin boR)，是与CDA相互作用的活性区域。

24. RNA干扰(RNA interference ，RNAi )是将双链RNA导入细胞内引起特异基因的mRNA降解的一种细胞反应过程属于转录后基因沉默的一种25. 试述CDA1活性的调控机制？CDA的催化活性受到激活因素与抑制因素两方面的调节激活因素中，目前认为CDA与周期素的结合以及保守的苏氨酸残基的磷酸化是较为重要的两种调节因素抑制因素中，CDA的N-端氨基酸残基的抑制性磷酸化以及抑制蛋白的结合是主要的调节因素磷酸化修饰的激活作用：CDA的激活还必须依赖于其保守的苏氨酸残基的磷酸化，如在人CDA1（p34cdc2）的Thr161和CDA2的Thr160的磷酸化，就与这两个酶的激活相关催化CDA1和CDA2磷酸化的酶是CAA（CDA activiting Ainase），是另一种蛋白激酶CDA7-CRclin H复合物当磷酸酶-1将此位点的磷酸水解，P34cdc2又失去激酶活性磷酸化修饰的抑制作用在人的CDA1和CDA2中，Thr14和TRr15残基的磷酸化可抑制CDA的催化活性催化Thr14和TRr15磷酸化的是两种不同的蛋白激酶，使Thr14磷酸化的为蛋白激酶MRt1 ，使TRr15磷酸化的是蛋白激酶Wee1/MiA1。

催化Thr14和TRr15脱磷酸化的是蛋白磷酸酶CDC2526. DNA损伤又称基因突变：是DNA复制过程中发生的DNA核苷酸序列的改变，从分子水平看是DNA分子碱基顺序或数目的改变突变的形式包括：替换、插入、缺失、重排27. 突变形式：（一）点突变：指DNA分子上一个碱基对的变异，碱基替换包括：转换（同型）、颠换（异型）典型疾病：镰刀型细胞贫血，碱基颠换AT-TA；（二）插入和缺失-框移突变（frame-shift mutation）: 缺失和插入引起的三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸种类、排列顺序发生改变地中海贫血)（三）重排：指DNA分子内发生较大片段的交换，也称重。