第五章-沉淀分离分析课件.ppt

第五章 沉淀分离5.1 概述5.2 盐析法5.3 有机溶剂沉淀法5.4 非离子多聚物沉淀法5.5 其他沉淀法5.1 概述沉淀的概念沉淀的概念 沉沉淀淀是是溶溶液液中中的的溶溶质质由由液液相相变变成成固固相相的的过过程程在生物工业、有机化工工业、无机化工工业及实验室分析中，沉淀都是分离与纯化中最常用的方法之一 沉淀： 溶质溶质固相固相5.1 概述沉淀的作用沉淀的作用有二： 一是浓浓缩缩，通过沉淀目的产物由液相变成固相，浓缩倍数可达几十倍至数百倍； 二是纯化纯化，通过沉淀固液分相后，除去留在液相（如果目的产物是固相）或沉积在固相中（目的产物留在液相）的杂质 沉淀法操作步骤沉淀法操作步骤 ：首先加入沉淀剂；首先加入沉淀剂；沉淀剂的陈化，促进粒子生长；沉淀剂的陈化，促进粒子生长；离心或过滤，收集沉淀物离心或过滤，收集沉淀物 加沉淀剂的方式和陈化条件对产物的纯度、收率和沉淀物的形状都有很大影响5.1 概述沉淀分离的应用沉淀分离的应用 沉淀分离具有成本低、收率高、浓缩倍数大和操作简单等优点，因而广泛应用于氨基酸、酶制剂、抗菌素等生物工业中 对于某些不需纯度要求的生物产品（如工业用酶制剂），沉淀分离是一种常用提取方法提取方法。

但对于某些纯度要求很高的生物产品，在沉淀分离中，浓缩作用常大于纯化作用，因而沉淀分离通常作为初步分离初步分离的一种方法 5.1 概述沉淀剂的选择 沉淀剂的作用是降低溶质的溶解度使之析出，除考虑沉淀效果外还需考虑下列因素：（1）沉淀剂对目的产物的结构与活性是否有破坏作用；（2）沉淀剂是否容易除去（离子交换、蒸发、萃取等）；（3）沉淀剂是否有毒性5.1 概述沉沉淀淀的的分分类类：沉淀法有许多种，根据所用沉淀剂的不同，生物工业中常用的沉淀方法有如下几种： 盐析法盐析法：多用于蛋白质和酶的分离纯化 有有机机溶溶剂剂法法：多用于生物小分子、多糖及核酸类产品的分离与纯化，有时也用于蛋白质和酶的沉淀 等等电电点点沉沉淀淀法法：用于氨基酸、蛋白质等两性物质的沉淀，但此法单独应用较少，多与其它方法结合使用5.1 概述 非非离离子子型型聚聚合合物物沉沉淀淀法法：用于生物大分子，是发展很快的一种方法 生生成成盐盐类类复复合合物物沉沉淀淀法法：用于多种化合物（其中主要是酸性或碱性化合物），其中小分子物质的沉淀应用较多 选选择择变变性性沉沉淀淀法法：热变性或酸碱变性沉淀法，常用于除去某些不耐热及在一定pH值下易变性的杂蛋白。

但应以在实验条件下所分离物质的活性不受影响为前提5.2 盐析法 一般说来，所所有有固固性性溶溶质质都都可可以以在在溶溶液液中中加加入入中中性性盐盐而而沉沉淀淀析析出出，这一过程称为盐盐析析盐析法具有如下特点：（1 1）成本低成本低，不需要什么特别昂贵的设备；（2）操作简单、安全操作简单、安全；（3）对许多生物活性物质具有稳定作用对许多生物活性物质具有稳定作用；（4）存存在在产产品品与与杂杂质质的的共共沉沉作作用用，因而它只能作为初步纯化初步纯化 5.2.1基本原理基本原理5.2.1.1盐析原理盐析原理蛋白分子的表面蛋白分子的表面同时含有带电荷的亲水基团亲水基团和不带电荷的疏水基团疏水基团蛋白质的溶解度差别取决于蛋白质分子中极性基团与非极性基团的比例和这些基团的排列位置 5.2.1.1盐析原理盐析原理（1）水合作用水合作用：在水溶液中，蛋白质分子中的亲水基团吸聚着许多水分子，这种作用称为水合作用这些水分子在蛋白质分子的表面形成一层水化膜水化膜由于水膜的存在，各蛋白质分子间彼此隔开，使蛋白质分子在水中呈溶解状态 5.2.1.1盐析原理盐析原理（2）盐溶作用盐溶作用(Salt-in)(Salt-in)：蛋白质在低盐浓度下发生盐溶蛋白质在低盐浓度下发生盐溶，这是因为当向蛋白质溶液中加入少量中性盐时，中性盐离子对蛋白质分子表面亲水基团（及水活度）的影响，增强了蛋白质分子与水分子的相互作用力，从而使蛋白质的溶解度增大。

蛋白质溶液少量中性盐 增加蛋白质分子与水分子的相互作用蛋白质溶解度5.2.1.1盐析原理盐析原理蛋白质在高盐浓度下发生盐析，这是因为当中性盐浓度增加至一蛋白质在高盐浓度下发生盐析，这是因为当中性盐浓度增加至一定程度时，蛋白质表面电荷被大量中和（亲水基团被大量中性盐定程度时，蛋白质表面电荷被大量中和（亲水基团被大量中性盐离子所包围），水分子离开蛋白质的周围，暴露出疏水区域，疏离子所包围），水分子离开蛋白质的周围，暴露出疏水区域，疏水区域间的相互作用，使蛋白质分子相互聚集而沉淀水区域间的相互作用，使蛋白质分子相互聚集而沉淀 （3）盐析作用（盐析作用（Salting-out)Salting-out)： 加入大量中性盐 蛋白质溶液亲水基团被中性盐包围 疏水基团的相互作用蛋白质相互聚集（溶解度下降） lgS （溶解度）I （离子强度） 盐溶盐析 图5-1 溶液离子强度与蛋白质浓度的关系5.2.1.2 Cohn方程式蛋白质盐析时，蛋白质的溶解度与盐浓度的关系可由Cohn经验公式来表示： （5-1）其中： （5-2）式中：S 蛋白质的溶解度（g/L） I 离子强度 mi i离子的摩尔浓度（mol/L） Zi i离子所带的电荷数（即离子的价数） 盐析常数，与盐的种类无关 KS 盐析常数，与温度和pH无关关于关于值：值：（1）值值与与盐盐的的种种类类无无关关，在式（5-1）中，令I=0，则： =lg S0 （5-3） S0表示在纯溶剂中（即I=0）蛋白质的溶解度，由此可见是一个与盐的种类无关的常数。

值的大小主要决定于蛋白质的性质2）值不可能直接测定值不可能直接测定 值是假定离子强度I=0时，用外推法求出的事实上由于盐溶作用的存在，I=0时的溶解度比低盐溶液要低3）值随温度和值随温度和pH而变而变 关于关于KS主要取决于蛋白质和盐的种类，取决于蛋白质和盐的种类，而与温度和而与温度和pH无关1）KS与蛋白质种类的关系与蛋白质种类的关系对于不同的蛋白质，KS值的变化不是很大，大多不超过1倍一般地：组成相同的蛋蛋白白质质，分分子子量量越越大大，KS较较大大，沉淀所需用用盐盐量量越越少少；蛋白质分分子子不不对对称称性越大性越大，KS值较大值较大，越容易沉淀越容易沉淀如表5-2所示为采用硫酸铵盐析时不同蛋白质的盐析常数 表5-2 硫酸铵对不同蛋白质的盐析常数 蛋白质 马血红蛋白 马肌红蛋白 卵青蛋白 纤维蛋白原 KS 0.71 0.94 1.22 1.46 （2）KS与盐种类的关系与盐种类的关系不同种类的盐，对KS的影响较大KS值较大，就意味着该盐的盐析效果好，其中阴离子的影响较显著阴离子的影响较显著，而阳离子的影响是第二位的对于阴离子阴离子，含高价高价阴离子的盐，效果比低价的好比低价的好常用阴离子的盐析效果排列如下：柠檬酸盐柠檬酸盐POPO4 43-3-SOSO4 42-2-CHCH3 3COOCOO- - ClCl- -NONO3 3- -SCNSCN- -对于阳离子阳离子，一般地高价高价阳离子（如Mg2+、Ca2+）不不如低价如低价阳离子，常用一价阳离子的盐析效果排列如下： NHNH4 4+ + K K+ + NaNa+ +而常用盐析剂盐析效果的排列顺序为： NaHNaH2 2POPO4 4 (NH(NH4 4) )2 2SOSO4 4NaNa2 2SOSO4 4MgSOMgSO4 4NaClNaCl表5-1 不同盐类对碳氧血红蛋白的KS值和值 用不同盐类采用外推法求值时，因温度和pH等条件不同，值会有所变动。

如表5-1所示，各种盐类对碳氧血红蛋白的值在3.0左右 盐种类 磷酸钾 硫酸钠 硫酸铵柠檬酸钠 硫酸镁 3.01 2.53 3.09 2.60 3.23 KS 1.00 0.76 0.71 0.69 0.335.2.1.3 分段盐析法分段盐析法 （1）KS分段盐析法分段盐析法改变离子强度改变离子强度对于蛋白质混合物，不不同同蛋蛋白白质质在在不不同同离离子子强强度度下下的的溶溶解解度度不不同同，发生盐析时所需的离子强度也就不同根据这一原理，采用不同离子强度分步盐析的方法，即可从蛋白质混合物中分离各种不同的组份如： 硫酸铵饱和度硫酸铵饱和度开始析出的蛋白质种类开始析出的蛋白质种类20%纤维蛋白原纤维蛋白原2833%血红蛋白血红蛋白3335%拟球蛋白拟球蛋白50%清蛋白清蛋白80%肌红蛋白肌红蛋白这这种种改改变变离离子子强强度度的的分分段段盐盐析析法法称称为为KS分分段段盐盐析析法法，常用于粗蛋白质和酶的分段分离204060800100总蛋白总蛋白目标蛋白质目标蛋白质最适饱和度是30%，55%5.2.1.3 分段盐析法分段盐析法 （2）分段盐析法分段盐析法改变改变pH和温度和温度不同蛋白质在不同温度和不同蛋白质在不同温度和pH值下的溶解度不同值下的溶解度不同，因此在一定离子强度下改变混合液pH和温度亦可实现分段盐析的目的。

由于这种方法是通过改通过改值的大小值的大小来实现的，因而叫做做分段盐析法分段盐析法此法常用于蛋白质的进一步纯化和结晶时使用 5.2.2 影响盐析的若干因素影响盐析的若干因素 5.2.2.1 蛋白质的浓度与盐析的关系蛋白质的浓度与盐析的关系从Cohn式可知，当蛋白质浓度较低时，发生盐析时需要较高的离子浓度如用硫酸铵盐析碳氧肌红蛋白（COMb）时：蛋白质起始浓度蛋白质起始浓度COMb开始沉淀时开始沉淀时硫酸铵的饱和度硫酸铵的饱和度90%的的 COMb沉沉 淀淀 析析出时硫酸铵的饱和度出时硫酸铵的饱和度30g/L58%65%3g/L66%73% 由此可见，在不同浓度的蛋白质溶液中进行盐析，使用硫酸铵的饱和度是不相同的 5.2.2.1 蛋白质的浓度与盐析的关系蛋白质的浓度与盐析的关系用用于于分分步步分分离离提提纯纯时时，一般采采用用较较稀稀的的蛋蛋白白质质溶溶液液，多加一些中性盐，使共沉作用减少至最低限度，一一般般采用的蛋白质浓度为为2.53.0%蛋白质起始浓度高蛋白质起始浓度高蛋白质起始浓度低蛋白质起始浓度低5.2.2.2pH对盐析的影响对盐析的影响蛋白质净电荷越多蛋白质净电荷越多它的溶解度越大溶解度越大 值(lgS0)就越高越高。

改变改变溶液的pH即可改变蛋白质分子所带净电改变蛋白质分子所带净电荷的数量荷的数量从而改变改变值值的大小当当pH值为值为蛋白质的等电点（pI）时时，蛋白质分蛋白质分子上的净电荷数为零子上的净电荷数为零，溶解度最小，溶解度最小，值最低因此在盐析时常选择溶液pH在该蛋白质的等电点附近pH两种蛋白质的相对溶解两种蛋白质的相对溶解度会随度会随pHpH而变化很大；而变化很大；随随pH pH 变化变化（1 1）对数关系）对数关系（2 2） 等电点附近有极小值等电点附近有极小值5.2.2.2pH对盐析的影响对盐析的影响（1）pH值对盐析的影响较大：由于=lgS0， 当值增加值增加1 1时，溶解度（S S）就增加增加1010倍倍对某些蛋白质，在一定盐浓度下，不同的pH下的值相差达3倍以上，也即蛋白质溶解度的变化达1000倍以上因此，盐析过程中pH的控制是非常严格的2）关于pI值：在水中或稀在水中或稀盐盐溶液中溶液中测得的蛋白的蛋白质质等电点（pIpI），与高与高盐浓盐浓度下度下所测的结果不一定相同不一定相同因此需根据实际情况调整pH值至蛋白质溶解度最低处，才能获得更好的效果 5.2.2.3 温度对盐析的影响温度对盐析的影响 一般说来，温度升高，溶质的溶解度增大一般说来，温度升高，溶质的溶解度增大。

1）在低盐溶液或纯水中）在低盐溶液或纯水中，生物大分子的溶解度生物大分子的溶解度大多数在一定范围内随温度的升高而增加；随温度的升高而增加；（2）在高盐溶液中）在高盐溶液中，生物大分子的溶解度随温度的升高生物大分子的溶解度随温度的升高而减少而减少，这是因为较高的温度会使蛋白质分子失水较高的温度会使蛋白质分子失水，因而利于沉淀3）尽管较高的温度有利于盐析沉淀，但较高温度易使蛋白质变性。