植物基因的遗传转化.ppt

第九章 植物基因的遗传转化n 第一节 DNA直接导入基因转化n 第二节 种质系统介导基因转化n 第三节 农杆菌介导的基因转化n 第四节 植物基因转化系统的选择策略第一节 DNA直接导入基因转化一、化学诱导DNA的直接转化PEG介导基因转化 二、物理诱导DNA直接转化基因枪法介导基因转化电击法介导基因转化nDNA直接导入转化就是不依赖农杆菌载体和 其他生物媒体，将特殊处理的裸露DNA直接 导入植物细胞，实现基因转化的技术 又成无载体DNA介导转化）nDNA直接转化技术根据其原理可分为化学法 和物理法两类一、PEG介导基因转化n化学诱导DNA直接转化是以原生质体为受体，借助 特定的化学物诱导DNA直接导入植物细胞的方法n PEG介导基因转化是Davey等（1980）和Krens等 （1985）首先建立的一）原理n化合物聚乙二醇（PEG）、磷酸钙及高PH值条件下 诱导原生质体摄取外源DNA分子n PEG是细胞融合剂，可以使细胞膜之间或使DNA与 膜形成分子桥，促使相互间的接触和粘连，且可引 起膜表面电荷的紊乱，干扰细胞间识别，有利于细 胞膜间的融合和外源DNA进入原生质体二）步骤n质粒DNA的提取（可以是Ti质粒，也可直接提取某 一植物的DNA作目的基因）；n原生质体的分离；n转化培养：将新制备的原生质体悬浮液与质粒DNA 保温培养，同时加入PEG，在PH8－9下促进原生质 体摄取DNA，使细胞转化；转化培养同时加入运载 DNA，即鲑鱼精DNA促进转化；n离心收集原生质体；n将原生质体按一般方法培养，当细胞团长到一定大 小时，将细胞团转移至含选择压力的培养基种筛选 转化细胞。

三）转化率及影响因素 nPEG诱导直接基因转化方法获得的转化率很低，约 10－5－10－6主要因为原生质体培养本身成功 率很低影响转化率的因素：n加入DNA与PEG的次序明显影响转化率，DNA应在 PEG处理前加入；n加入PEG，其最终浓度一般需20%;n用含MgCl2的溶液或CaCl2处理原生质体能显著提高 转化率；nDNA构象对转化率有很重要影响，线性DNA比环形 DNA对植物细胞的转化更有效；n加入携带DNA能提高转化效率，如鲑鱼精DNA；n 在细胞周期的S期或M期时的转化率明显高于其它 时期，可以用2、4－二氯甲晴处理，使细胞进入S 期和M期，提高转化率n 在PEG处理前，用低剂量x射线或紫外线处理原生 质体，可使更多的细胞有效地整合外源基因；n外源DNA的浓度对转化的影响：在一定DNA浓度 范围内（10－60ug/ml），转化率随DNA浓度增 加而递增；n原生质体的浓度的影响：原生质体1.0x106个/ml 比较好；nPH值对PEG转化的影响；当PH5.8-6.0时，转化处 理后的原生质体分散性好，转化率高四）特点n原生质体本身具有摄取外来物质的特性，PEG法是 利用生物生理功能来实现外源基因的导入，对细胞 的伤害小；nPEG法获得的转化再生植株来自一个原生质体，可 以避免嵌合转化体的产生。

nPEG法转化的原生质体易于选择转化体；n受体材料不受种类的限制，只要能建立原生质体再 生系统的植物都可以采用此法；困难：n建立原生质体再生系统困难，阻碍了PEG的应用；n转化效率低；n从原生质体再生的无性系植株变异较大二）电击法介导基因转化n物理方法是基于许多物理因素对细胞膜的影响，或 通过机械损失直接将外源DNA导入细胞可以原生 质体为受体，也可直接以植物细胞乃至组织、器官 为受体，比化学法更具广泛性和实用性n1985年李宝健等首先将电击法用于植物细胞的基因 转化，该法在禾谷类作物种更有发展潜力n原理：利用高压电脉冲作用在原生质体膜上电击穿 孔，形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的摄 取n分离的原生质体加入电击缓冲液，将原生质体密度 调节到1x106－2x106个/ml；n加入质粒DNA(10ug/ml)和鲑鱼精DNA（50ug/ml） ，混合后分装于电击反应槽内；n冰浴10min；n600r/min离心3min除去电击缓冲液，用液体培养基 洗涤；n将原生质体包埋于固体培养基中，28度黑暗调节下 选择培养一）步骤二）转化率及影响因素n电击法的转化率可达1.2%影响因素：n电击的处理方式对转化率有决定性作用，一般采用 高电压、短时间(1-1.25kv/cm, 10s)处理比较好;n使用的电场强度、波形及处理时间对转化率有极为 重要影响，在一定范围，增加场强，延长脉冲持续 时间能提高转化率。

n在电击处理时，有PEG存在对转化率有重要促进作用 ；n加入运载DNA可以提高转化率；n原生质体所处的介质成分也会影响转化率，原生质体 应悬浮在便于进行电击的具有特定电阻的盐溶液中；n其它因素如Ca离子浓度、PH值，质粒DNA浓度对转 化率都要影响三）特点n优点：电击法除具有PEG原生质体转化的优 点外，还具有操作简便，转化效率较高，特 别适合瞬式表达的研究；n缺点：易造成原生质的损伤，使植板率降低 ；仪器较昂贵三、基因枪法介导基因转化n基因枪法又称微弹轰击法，由美国的Sanford等（ 1987）研制，至1990年美国杜邦公司推出商品基 因枪PDS－1000系统，基因枪有了很大发展一）基本原理将外源DNA包被在微小的金粉或钨粉颗粒表面， 然后在高压的作用下微粒被高速射入受体细胞或 组织，微粒上的DNA进入细胞后，整合到植物染 色体上，得到表达，从而实现基因的转化n根据基因枪的动力系统，可分为三类：n第一类是火药爆炸力为加速动力n第二类是以高压气体作为动力，如氦气、氢气、 氮气等；n第三类是以高压放电为驱动力其最大的优点是 可以无极调速，通过变化工作电压，粒子速度及 射入浓度可准确控制，使载有DNA的金（钨）粉 粒子能到达具有再生能力的细胞层。

二）分类三）步骤1）微粒体的洗涤；2）DNA微弹载体的制备；原理是CaCl2对DNA沉淀作用，亚精胺、聚乙二醇 具有黏附作用，将这些化合物与DNA混合后与金（ 钨）粉混合，吹干后，则DNA沉淀在载体颗粒上3）靶外植体材料的准备；4）DNA微弹轰击；5）轰击后外植体的培养四）转化率及影响因素n基因枪法的转化率一般在103－102范围影响因素：n金属微粒的影响：钨粉，廉价易得，制备容易，但 会产生一层对植物有害的氧化物；比钨粉具有更规 则的球形体积，可以在相同体积下取得最大的附着 面积，化学性质更为稳定，对DNA的吸附力更强， 但价格较昂贵nDNA沉淀辅助剂的影响：目前常用的沉淀辅助剂 CaCl2、亚精胺、聚乙二醇这些化合物的浓度不仅 对DNA在金粉或钨粉上的黏附有重要影响，而且对 植物受体细胞的伤害也至关重要nDNA的纯度及浓度对转化率的影响：DNA纯度越高 越容易获得成功的转化，另外，加入携带DNA可提 高转化率，但混杂的DNA其干扰作用；在一定范围，DNA浓度高，可以获得较好的转化效 果，但DNA浓度过高也会使金属微粒凝聚成块，反 而降低转化率n微弹速度的影响：基因枪的轰击参数，如粒子速度 、入射浓度、阻挡板至样品室外的高度、轰击次数 等均影响基因介导转化率，其中微弹的速度是影响 转化率的一个重要因素。

它直接决定了微弹对细胞 和组织的作用力及产生损伤的程度n植物材料的内在因素的影响：在基因转化中起主导 作用是植物细胞本身，因此，植物受体细胞本身的 因素在转化中起主要作用这些生物因素包括外植体的种类、细胞的生理状态 、细胞潜在的再生能力、轰击前后的培养条件以及 细胞内环境对外源DNA的接受能力等等一个重要原则是潜在分裂能力的细胞才具有接受外 源DNA的可能五）特点优点：n无宿主限制：n靶受体类型广泛；n可控性高；n操作简单快速；缺点：n转化频率偏低；n多基因整合；需进一步研究的问题：n基因枪的硬件设计尚待改善；n微 弹的表面结构、大小、均一性及承载DNA 的量 及DNA微粒载体的制备技术；n特定物种，特定组织、细胞的轰击条件；n如何诱导更多的细胞同时成为转化和再生感受态；n轰击后进入受体细胞的DNA生物学变化及其调控等 理论问题第二节 种质系统介导基因转化n种质转化系统又称生物媒体转化系统，即基因转移主 要是利用花粉粒及花粉管通道，利用子房、幼穗及种 胚注射外源DNA等方法导入外源基因特点：n转化的DNA可以是裸露的，也可以重组在质粒DNA 上 ；n转化过程依靠生物自身的种质系统或细胞结构功能来 实现；n不需要植物组织细胞原生质体等离体培养过程；n植物整体水平上的转化。

一、花粉管通道法介导基因转化n该技术是由周光宇等1983年建立和发展起来一）原理n授粉后使外源DNA能沿着花粉管渗入，经过珠 心通道进入胚 转化沿不具备正常细胞壁的卵 、合子或时期胚胎细胞二）操作程序n外源DNA制备1）从植物提取DNA；2）从细胞中提取质粒DNA，酶切后制备成符合要 求的外源DNA导入液；3）从农杆菌中提 取已重组构建的Ti质粒，酶切后 制备成符合要求的外源DNA导入液；n分析受体植物受精过程及时间，确定导入外源DNA 的时间及方法n外源DNA 导入受体植物1）柱头涂抹法；2）柱头切除法；3）花粉粒吸入法；n后代材料处理三）技术评价优点：1）无需细胞原生质体等组织培养和诱导再生植株 等一整套人工培养过程；2）方法简便，育种时间缩短；3）可以任意选择生产上的当家品种进行外源DNA 导入；转化率的影响因素：转化率：花粉管导入法的成株转化率10-2－10-1影响因素：1）花粉管导入的关键因素在于精确掌握受体植物的 受精过程及时间规律，恰当应用花粉管途径达到外 源DNA导入的目的；2）DNA导入液的浓度PH值的影响；3）DNA 的分子结构及片断大小的影响，环状分子难 以转化大片断DNA转化率低；四）存在问题n这一技术局限于开花时间才能应用；n外源DNA能否与受体基因整合决定于目的性状的基因 的结构与功能能否与受体基因组DNA和细胞代谢相容 ；nDNA的大小应注意，过大易断裂，过小遗传功能丧失 ；二、胚囊、子房注射法介导基因转化一）原理使用显微注射仪把外源DNA溶液注入子房或胚囊中，由于子房或胚囊中产生高的压力及卵细胞的 吸收使外源DNA进入受精的卵细胞中，从而获得 转基因植株。

n外源DNA制备；n外源DNA注射的时间，原则上注射的时间应在卵 细胞受精后，到第一次细胞分裂前这段时间，外 源基因易于整合；n外源DNA注射的部位；n操作；n后代材料的筛选；二）操作程序第三节 农杆菌介导的基因转化一、植物基因工程载体及其构建 二、根癌农杆菌Ti质粒介导基因转化一）植物基因工程载体的种类及特性n根据植物基因工程载体的功能及构建过程，把载体分 为四大类型：n目的基因的克隆载体：通常由多拷贝的大肠感觉质粒为载体 ，其功能是保存和克隆目的基因n中间克隆载体：由大肠杆菌质粒插入T-DNA片段及目的基因 、标记基因等构建而成是构建中间表达载体的基础质粒n中间表达载体：是含有植物特异启动子的中间载体，其功能 是作为构建转化载体的质粒n卸甲载体：是解除武装的Ti质粒或Ri质粒，其功能是作为构 建转化载体的受体质粒n植物基因转化载体：是最后用于目的基因导入植物细胞的载 体，亦称工程载体它由中间表达载体和卸甲载体构建而成 分为一元载体系统和双元载体系统二）根癌农杆菌Ti质粒的结构与功能1、Ti质粒的遗传特性及类型nTi质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双 股共价闭合的环状DNA 分子，约由200kb组成。

n根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱种类 不同，Ti质粒可以被分成四种类型：章鱼碱型、 胭脂碱型、农杆碱型和琥珀碱型Ti质粒的基因位点及其功能区域nT-DNA区：是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上 切割下来转移到植物细胞的一段DNA，又称转移 DNA；该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关nVir区：该区段的基因能激活T-DNA转移，时农杆 菌表现除毒性，又称毒区nCon区：该区段上存在着与细菌间结合转移的有关 基因，调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。