人幽门螺旋杆菌IgM(HP-IgM)酶联免疫分析（ELISA）.doc

人幽门螺旋杆菌IgM(HP-IgM)酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用 目的：本试剂盒用于检测人血清，血浆中幽门螺旋杆菌IgM(HP-IgM)水平实验原理： 本试剂盒采用双抗原夹心酶联免疫法（ELISA）测定标本中人幽门螺旋杆菌IgM(HP-IgM)用纯化的抗原包被微孔板，制成固相抗原，可与样品中幽门螺旋杆菌IgM(HP-IgM)相结合，经洗涤除去未结合的抗体和其他成分后再与HRP标记的抗原结合，形成抗原-抗体-酶标抗原复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），与CUTOFF值相比较，从而判定标本中人幽门螺旋杆菌IgM(HP-IgM)的存在与否试剂盒组成：试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2片（48）2片（96）密封袋1个1个酶标包被板1×481×962-8℃保存阴性对照0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存阳性对照0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存样本处理及要求：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心胸腹水、脑脊液参照实行4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集离心20分钟左右（2000-3000转/分）仔细收集上清检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份离心20分钟左右（2000-3000转/分）仔细收集上清保存过程中如有沉淀形成，应再次离心5. 组织标本：切割标本后，称取重量加入一定量的PBS，PH7.4用液氮迅速冷冻保存备用标本融化后仍然保持2-8℃的温度加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分离心20分钟左右（2000-3000转/分）仔细收集上清分装后一份待检测，其余冷冻备用6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。

若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.7. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性操作步骤：1. 编号：将样品对应微孔按序编号，每板应设阴性对照2孔、阳性对照2孔、空白对照1孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）2. 加样：分别在阴、阳性对照孔中加入阴性对照、阳性对照50μl然后在待测样品孔先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，3. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟 4. 配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液加蒸馏水至600ml后备用5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干6. 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外 7. 温育：操作同38. 洗涤：操作同59. 显色：每孔先加入显色剂A 50μl，再加入显色剂B 50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟10. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）11. 测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。

测定应在加终止液后15分钟以内进行结果判定： 试验有效性：阳性对照孔平均值≥1.00; 阴性对照平均值≤0.10 临界值（CUT OFF）计算：临界值=阴性对照孔平均值+0.15 阴性判定：样品OD值< 临界值（CUT OFF）者为人幽门螺旋杆菌IgM(HP-IgM)阴性 阳性判定：样品OD值≥ 临界值（CUT OFF）者为人幽门螺旋杆菌IgM(HP-IgM)阳性注意事项1．操作严格按照说明书进行，本试剂不同批号组分不得混用2．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存3．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果4． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染5．底物请避光保存6．试验结果判定必须以酶标仪读数为准，使用双波长检测时，参考波长为630nm7．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理终止液为2M的硫酸，使用时必须注意安全保存条件及有效期1．试剂盒保存：；2-8℃2．有效期：6个月Human HP-IgM FOR RESEARCH USE ONLY Drug NamesGeneric Name：Human HP-IgM ELISA Kit.PurposeThis kit allows for the determination of HP-IgM concentrations in Human serum, and other biological fluids.Principle of the assayThe kit assay HP-IgM level in the sample，use Purified antigen to coat microtiter plate wells, make solid-phase antigen, then add HP-IgM to wells, Combined With HP-IgM, after washing and removing non-combinative antibody and other components ,then Combined antigen which with HRP labeled become antigen - antibody - enzyme- antigen complex, after washing Completely, Add TMB substrate solution,, TMB substrate becomes blue color At HRP enzyme-catalyzed, reaction is terminated by the addition of a sulphuric acid solution and the color change is measured spectrophotometrically at a wavelength of 450 nm. Compared with the CUTOFF value, according to this to judge HP-IgM exist in the sample or not.Materials provided with the kitMaterials provided with the kit48determinations96 determinationsStorageUser manual11Closure plate membrane22Sealed bags11Microelisa stripplate112-8℃Negative control0.5ml×1 bottle0.5ml×1 bottle2-8℃Positive control0.5ml×1 bottle0.5ml×1 bottle2-8℃HRP-Conjugate reagent3ml×1 bottle6ml×1 bottle2-8℃Sample diluent3ml×1 bottle6ml×1 bottle2-8℃Chromogen Solution A3ml×1 bottle6ml×1 bottle2-8℃Chromogen Solution B3ml×1 bottle6ml×1 bottle2-8℃Stop Solution3ml×1 bottle6ml×1 bottle2-8℃wash solution（20ml×20 fold）×1bottle（20ml×30 fold）×1bottle2-8℃Specimen requirements1. serum- coagulation at room temperature 10-20 mins，centrifugation 20-min at the speed of 2000-3000 r.p.m. remove supernatant, If precipitation appeared, Centrifugal again.2. plasma-use suited EDTA or citrate plasma as an anticoagulant,mix 10-20 mins ,centrifugation 20-min at the speed of 2000-3000 r.p.m. remove supernatant, If precipitation appeared, Centrifugal again.3. Urine-collect sue a sterile container, centrifugation 20-min at the speed of 2000-3000 r.p.m. remove supernatant, If precipitation appeared, Centrifugal again. The Operation of Hydrothorax and cerebrospinal fluid Reference to it.4. cell culture supernatant-detect secretory components, collect sue a sterile container, centrifugation 20-min at the speed of 2000-3000 r.p.m. remove supernatant,detect the composition of cells, Dilut cell suspension with PBS（PH7.2。