实验一凝集反应.docx

医学免疫学实验讲义实验一 凝集反应在一定浓度的电解质溶液中，颗粒性抗原与相应抗体结合后，出现肉眼可见的凝集块，称 为凝集反应(agglutination reaction)凝集反应是一种定性的检测方法，即根据凝集现象的出现 与否判定结果阳性或阴性；也可以进行半定量检测，即将标本作一系列倍比稀释后进行反应， 出现阳性反应的最高稀释度作为滴度(或效价)来判断结果的强弱凝集反应可分为直接凝集 反应和间接凝集反应由于凝集反应方法简便，目前在临床检验中仍被广泛应用一、直接凝集反应细菌、细胞等颗粒性抗原，在适当电解质参与下可直接与相应抗体结合出现凝集，称为直 接凝集反应(direct agglutination reaction)o凝集反应中的抗原又称为凝集原(agglutinogen)，抗 体称为凝集素(agglutinin)常用的直接凝集试验有玻片法和试管法两种一) 玻片凝集试验——ABO血型鉴定【原理】玻片凝集试验为定性试验，一般用已知抗体作为诊断血清，与受检颗粒性抗原如菌液或红 细胞，各加一滴在玻片上，混匀，数分钟后即可用肉眼观察凝集结果，出现凝集颗粒的为阳性 此法简便，快速，适用于从病人标本中分离得到的菌种的诊断或分型，也可用于红细胞ABO血 型的鉴定。

材料】1. 标准血清(抗体)：抗A分型试剂和抗B分型试剂各1支2. 盛有1ml生理盐水的一次性试管1支3. 一次性采血针1枚、白瓷板或玻片1块、一次性毛细吸管1支、75%酒精棉球和灭菌 干棉球方法】1. 用酒精棉球消毒被检者的耳垂或手指尖端，以采血针刺破皮肤，稍加挤压，使血液流出，滴1〜2滴血液于含有生理盐水的试管内，摇匀，使成为血球悬液用灭菌干棉球止血2. 取白瓷板1块，将抗A、抗B分型试剂分别滴加1滴于白瓷板的两个圆孔内3. 用毛细吸管吸取血球悬液，在白瓷板的两个圆孔内各加1滴4. 将白瓷板前后左右不停地摇动，使其充分混匀，5〜10min后观察血球有无凝集发生如 有凝集，可见红细胞凝集成块；无凝集，红细胞呈均匀分散(图 1)5. 记录受检者红细胞凝集情况，根据ABO血型鉴定表，判断受检者的血型表 1-1 A B O 血型鉴定表抗A分型试剂抗B分型试剂血型+－A－＋B＋＋AB－－O红细胞不凝集 红细胞凝集图1红细胞凝集判断示意图【注意事项】1. 采血前应对采血部位进行消毒2. 采血针必须一人一针，禁止混用，严防交叉感染3. 本法也可将血液直接滴在白瓷板或玻片上，而不必用生理盐水稀释，其结果不变。

二）试管凝集试验【原理】试管凝集试验是一种半定量的试验方法，常用于血清中抗体的测定，其浓度常以效价表示 即将待检血清在试管内作一系列倍比稀释，然后加入相应的颗粒性抗原，使其在试管内发生直 接凝集，以出现明显凝集（++）的血清最高稀释度为其效价（亦称为滴度）临床上常用的试管 凝集试验有：肥达试验（Widal test）和外斐试验（Weil-Felix test）材料】1. 诊断血清：1 ： 10稀释的伤寒杆菌“O”及“H”诊断血清2. 抗原：伤寒杆菌“O”菌液（菌体抗原），伤寒杆菌“H”菌液（鞭毛抗原）3. 生理盐水、小试管、吸管、试管架、水浴箱等方法】1. 取清洁小试管16支，分两排列于试管架上，每排8支，依次编号，每管内加生理盐水 0.5 ml2. 用1ml洁净吸管吸取伤寒杆菌“O”诊断血清0.5ml加入第一排的第1管内，于管内上 下吹吸3次，使血清与生理盐水充分混匀，吸出0.5ml加于第2管，同法混匀，吸取0.5ml加于 第3管，依次稀释至第7管，从第7管吸出0.5ml弃去第8管为生理盐水对照稀释方法如 图2所示图2血清倍比稀释法3. 同法稀释第2排的伤寒杆菌“H”诊断血清4. 用1ml洁净吸管吸取伤寒杆菌“O”菌液，从第1排的第8管起依次向前在各管内加入0.5ml （表 1-2）。

5.另取1支lml吸管，同法于第2排各管中加入伤寒杆菌“H”菌液0.5ml6. 将各试管振汤混匀，放入37 C水浴箱中2〜4小时，初步观察结果后，置4 C冰箱过夜,表1-2试管凝集试验加样程序■单0. 50. 5J. 50. 50.5伤寒杆菌菌液0. 5 0. 5 0. 5血清稀释度 1 ： 4C 1 ： 80 1 ： 160 1 ： 320 1 : E40 1 : 1280 1 : 25E0 对照37°C水浴箱中2〜4小时，4°C冰箱过夜次日再行观察结果【结果】先观察第8管对照(图3),管底沉淀物呈圆形，边缘整齐，轻轻振摇细菌分散呈均匀浑浊， 此为阴性然后从第1管起，逐管观察，如有凝集，可见管底有凝集块，边缘不整齐，液体澄 清O”菌液的凝集呈致密颗粒状，不易摇散，“H”菌液的凝集呈疏松棉絮状，易摇散凝集强度的判断以“+”号表示如下：“++++”：很强，细菌全部凝集，液体澄清，管底有大片凝集物强，细菌大部分凝集，管底的凝集物较小，液体微混中等强度，细菌部分凝集，管底凝集物细小，但仍明显可见，液体半澄清 + ” ：弱，细菌仅少部分凝集，液体混浊不凝集，液体混浊与对照管相似不凝集 凝集以产生明显凝集(++)的血清最高稀释度为该血清的凝集效价。

凝集摇动后 的现象图3试管凝集结果示意图【注意事项】1. 加抗原时必须先从对照开始，然后从低浓度血清稀释度到高浓度血清稀释度依次加入2. “H”菌液的凝集很疏松，极易摇散，判断结果时应避免剧烈振动，以免影响结果注：效价是指机体对抗原产生免疫应答时，其血清中含有特异性抗体的浓度，常以出现阳性反应的血清最 高稀释度为效价(滴度)二、间接凝集反应将可溶性抗原或抗体先吸附于适当大小的颗粒性载体表面(这种载体与免疫无关)，然后与 相应抗体或抗原结合，在适量的电解质存在下,出现特异性凝集现象，称为间接凝集反应(indirect agglutination)或被动凝集反应(passive agglutination)这种反应适用于各种抗体和可溶性抗原的检测，其敏感度高于沉淀反应，因此被广泛用于临床检验其中将抗体吸附于载体表面检测 抗原的间接凝集反应称为反向间接凝集反应根据载体的不同可将间接凝集反应分为：间接血 球凝集试验、间接乳胶凝集试验（及间接乳胶凝集抑制试验）和金黄色葡萄球菌协同凝集试验一）间接血球凝集试验——血清类风湿因子测定【原理】以红细胞为载体，将人丙种球蛋白（可溶性抗原）吸附在载体表面而成为致敏红细胞，然 后用此致敏红细胞检测类风湿性关节炎患者血清中的类风湿因子（抗变性IgG抗体），当患者血 清中含有类风湿因子时红细胞发生凝集。

此方法常用于检测血清中的抗体，辅助诊断疾病材料】1. 致敏红细胞悬液2. 1 : 10待检血清、阳性对照血清、稀释液3. V型微量反应板、微量移液器、微量振荡器、37°C恒温箱、移液头方法】1. 用微量移液器吸取稀释液加于微量反应板的1〜9孔内，每孔50卩1，第10孔加50卩1阳 性对照血清2. 第1孔内加待检血清50卩1，混匀后吸出50卩1加于第2孔内，依次作倍比稀释至第8 孔, 并从第8孔中吸出50卩1弃去各孔的血清稀释度为1:20、1:40、1:80……第9孔为阴性对照， 第10孔为阳性对照3. 将致敏红细胞悬液混匀，从第9孔起依次向前各孔内加入50卩1致敏红细胞悬液4. 第10孔阳性对照加50卩1致敏红细胞悬液将反应板置于微量振荡器上，振荡lmin, 37C 静置30min后观察结果结果】先观察第9孔阴性对照孔中的红细胞应紧密集中于孔中央，成为一红点（图4）；第10孔 阳性对照孔中的红细胞应凝集并均匀地铺于孔的四周，孔中央无红细胞沉积的红点然后根据 孔中红细胞凝集现象及其强弱程度，分别以“+”表示如下：“+++” 一一红细胞凝集铺于孔的四周，有时因凝集过于强烈，会出现周边的凝集向孔心 滑动的现象，此时应注意不要误判为阴性（阴性：红细胞紧密集中于孔底，边缘整齐光滑）。

一一部分红细胞凝集，均匀铺于孔四周，孔中央可见疏松的红点 ――红细胞沉积为环形，直径比对照的大，环四周有凝集现象一一红细胞紧密集中于孔底，边缘整齐光滑以“++ ”的血清最高稀释度作为试验效价，凝集效价＞ 1:40判定为阳性红细胞不凝集 红细胞凝集图4 红细胞凝集判断示意图【注意事项】1. 在进行多样本血清稀释时，极易发生操作失误，因此，操作要仔细2. 加致敏红细胞悬液应从第9孔为阴性对照开始依次从低浓度向高浓度进行3. 观察结果时应轻拿V型反应板，避免已凝集的红细胞从孔壁滑落，造成凝集效价下降 或出现假阴性结果二)金黄色葡萄球菌协同凝集试验【原理】金黄色葡萄球菌细胞壁含有一种蛋白质，称为金葡菌A蛋白(staphylococcus protein A, SPA)SPA具有与人和多种哺乳动物IgG的Fc段结合而不影响其Fab段功能的特性利用SPA 这一特性，将已知的特异性抗体吸附于金葡菌上，与相应抗原发生的凝集反应即为协同凝集试 验(coagglutination)此方法常用于未知抗原的检测材料】1. 抗A群脑膜炎球菌抗体致敏的金葡菌液、未致敏的金葡菌液、生理盐水2. 毛细吸管、有格玻片。

方法】1. 在玻片的第1、2格分别加1滴致敏金葡菌液，第3格加未致敏金葡菌液2. 于第1、3格各加1滴病人脑脊液，第2格加1滴生理盐水，将玻片轻轻摇动3〜5min, 观察结果结果】第1格内细菌形成白色凝集，表明病人脑脊液中A群脑膜炎球菌阳性；第2格为致敏金葡 菌液对照，细菌不凝集；第3格为未致敏金葡菌液对照，细菌也不出现凝集(图6) 第1格 第2格 第3格 金葡菌凝集 金葡菌不凝集 金葡菌不凝集图6协同凝集试验结果示意图【注意事项】1. 在操作过程中要不断地摇动玻片，同时注意避免相互之间混合2. 气温较低的环境，应适当延长结果判断的时间，或提高实验环境的温度3. 当凝集不明显，或结果判断困难时，可将玻片置于显微镜下观察，判断细菌是否有凝 集现象实验二 沉淀反应可溶性抗原如血清、毒素、细菌浸出液等与相应抗体结合，当二者比例合适、并有适量电 解质存在时，形成肉眼可见的沉淀物或沉淀线，称为沉淀反应precipitation）参与沉淀反应的 抗原称为沉淀原、抗体称为沉淀素由于参与反应的抗原为可溶性，分子小，单位体积内所含 的抗原量多，与抗体结合的总面积大，因此，在实验中常常稀释抗原以保持抗原与抗体合适的 比例，并以抗原的稀释度作为沉淀反应的效价。

沉淀反应是免疫实验中最常用、最基本的方法之一它的种类较多，可分为琼脂扩散试验 免疫电泳试验、环状沉淀试验及絮状沉淀试验等一、琼脂扩散试验利用可溶性抗原与相应抗体在半固体琼脂内进行扩散，当二者比例合适时，就出现白色沉 淀线，此方法称为琼脂扩散试验本试验可在试管内、平皿中以及玻片上的琼脂内进行操作琼脂扩散试验可分为单向琼脂扩散试验和双向琼脂扩散试验扩散与电泳结合又有多种方 法，如对流免疫电泳、火箭电泳及交叉免疫电泳等一）单向琼脂扩散试验【原理】单向琼脂扩散试验（single agar diffusion）是一种定量试验将一定量的抗体与琼脂混合， 倾注于玻璃板上，凝固后，在琼脂层中打孔，再将抗原加入孔中孔中抗原向四周扩散（分子 量＜。