实验五 育种植物花药培养技术.doc

实验五植物花药培养技术一、实验目的了解植物花药培养原理及在遗传育种上的意义，掌握植物花药培养技术二、实验原理及相关内容说明利用花药培养技术，将配子培育成单倍体，经染色体加倍而成双单倍体纯合 个体，再经选择即可得到优异的纯系，从而可提高选择效率，缩短育种周期此 外，花药培养在克服远缘杂种的不育性，快速高效地创造染色体工程的基础材料, 以及在细胞水平特别是单倍体细胞水平上进行诱变，提高诱变育种效率等方面也 具有很大的应用潜力植物花药培养的一般程序是：镜检选取发育适期的花药并接种到诱导培养基 上，诱导出愈伤组织；然后将愈伤组织转移到适宜分化的培养基上，促使分化成 苗；最后将根系发育良好的健壮幼苗移栽，培育成花粉植株以供选育三、 材料、仪器及药品1、 材料大花紫薇或其它的植物2、 仪器用具超净工作台、高压灭菌锅、显微镜、分析天平、锥形瓶、烧杯、量筒、移液 管、容量瓶、镶子、酒精灯、玻棒、棉花、牛皮纸、橡皮筋、pH精密试纸等3、 药品试剂培养基、75%酒精、95%酒精、1%或2%的次氯酸钠溶液或0.1 %的升汞、蒸 偏水、无菌水、培养基成分、6.节氨基腺喋吟（6-BA）、荼乙酸、□引口朵乙酸等四、 方法步骤1、配制培养基（1）.配制母液a. 大量元素母液（I0X ）：按培养基配方分别称取10倍所需量的各种大量 元素的无机盐，依次溶于重蒸水中，最后定容至1000毫升。

b. 微量元素母液（100X）：按培养基配方分别称取100倍所需量，同上c. 有机附加物母液（1000X）：同上d. 生长素类物质母液：生长素类物质单独配成母液IAA、NAA配制母液 时先用95%酒精溶解；6-BA需先用1摩尔/升HC1或NaOH溶解e. 铁盐母液（100X ）：分别称取100倍用量的Na2EDTA和FeSO4.7H2O分 别溶解后混合定溶f. 其他成份如蔗糖、琼脂等可在配制培养基时称取所需用量加入g. 配制好的各母液，贴上标签，标明药品名称和母液含量，放入冰箱备用2) .配制培养基a. 根据需配培养基的量，吸取所需母液量，加入蔗糖6%〜10%、琼脂及附 加成分，定容到10()0毫升，用1摩尔/升NaOH或HC1调pH值为5.8b. 趁热将培养基分装到培养瓶中，每瓶约装培养基25毫升，盖上瓶盖3) .培养基的灭菌a. 将分装好的培养基、所需的无菌水及其他接种用具用牛皮纸包扎好后， 放入高压灭菌锅，在0.8〜1.0千克/平方厘米下灭菌20分钟b. 灭菌后取出培养基，放在温度相近的培养室冷却，以免因温差太大，使 培养基瓶中凝成过多的水珠，增加污染机会2、花药培养(1) .花粉发育时期的鉴定一般宜选用小泡子发育处于单核中、晚期的花药进行培养。

a. 形态观察：观察不同发育时期的花蕾的形态特征b. 镜检鉴定：将花药取出，在载玻片上，轻轻涂抹，滴1滴醋酸洋红，盖 上盖玻片，镜检如细胞核位于中央，为单核早期；细胞核偏离中央，逐 步出现小液泡，为单核中期；当细胞核被挤到萌发孔对面，中央形成大液 泡，为单核晚期大部分小跑子处于单核中、晚期)c. 经过鉴定明确合适的花蕾长度，方便培养时取材2) .花药的接种a. 洗净双手，用75%酒精擦洗，花蕾先用75%酒精浸泡30秒，再浸入1% 次氯酸钠1()〜15分钟或0.1%升汞溶液中8〜10分钟，无菌水冲洗3次b. 用镶子将花药取出，去除花丝，放入装有培养基的培养瓶内，接种后盖 上盖子，封口并写明接种材料、日期、接种人锥形瓶)注意(3) .胚状体或愈伤组织的诱导a. 愈伤组织诱导一般用MS基本培养基，附加一定量的生长素类和细胞 分裂素类物质，可加0.5-1.()毫克/升6-BA、2.()毫克/升IAA等b. 将接种到愈伤组织诱导培养基上的花药置于25〜28笆的恒温室内进行 暗培养，约15天可陆续长出愈伤组织或胚状体)图片(4) .愈伤组织的分化与移栽a. 分化培养基一般用MS基本培养基，加1.0〜2.0亳克/升KT、或1.0〜2.() 毫克/升6-BA、().5〜1.0毫克/升NAA,蔗糖浓度改为3%。

b. 当愈伤组织长到直径2〜3毫米大小时转移到分化培养基上，置于 23〜28C恒温室内，每天光照9〜11小时，光强2000勒克斯以上一•般约在2周 后愈伤组织分化出绿芽或根c. 待绿苗长到5〜10厘米时移栽，移栽前根部的培养基洗净，练苗五作业与思考题每人接种1瓶花药，根据自己的实验体会，总结花药培养过程中如何避免 污染？。