粉和平月季植株再生体系建立研究.docx

    粉和平月季植株再生体系建立研究    摘 要：以试管苗的幼嫩小叶为外植体，探讨了粉和平月季通过诱导愈伤组织建立植株再生体系的方法结果表明：2,4-D能有效诱导无菌小叶产生愈伤组织，经5.0 mg/L的2,4-D光下诱导愈伤20 d后，愈伤组织诱导率最高可达91.11％，且其愈伤质量最优将生长良好的愈伤组织转至TDZ浓度为0.5～2.0 mg/L的MS培养基中发现，暗培养8～16 d均能诱导愈伤组织产生不定芽，但暗培养时间超过16 d愈伤组织容易褐化死亡在含1.2 mg/LTDZ的MS培养基上暗培养14 d后其不定芽诱导率可达30%将生长良好的不定芽转入壮苗培养基MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.01 mg/L中培养25 d左右，组培苗芽枝叶粗壮，生长旺盛；将长至2～3 cm长的健壮小苗转入生根培养基，生根率最高仅为8% Keys：月季； 粉和平； 愈伤组织； 植株再生S685.12 ：A ：1004-874X(2010)04-0077-04月季（Rosa hybrida）是世界公认的重要观赏植物，被誉为“花中皇后”长期以来，月季繁殖主要以传统的嫁接、扦插等方法为主，其缺点是繁殖系数低、繁育周期长。

利用组织培养技术既可以克服上述问题，又能为月季遗传改良的转基因研究奠定基础近年来，国内外对月季组培苗叶片的组织培养技术进行了大量研究，目前通过直接或间接的器官发生途径，以叶片、茎段、花瓣和花丝等为外植体，许多月季品种的组织培养都获得了成功[1-4]，但仍存在通过间接器官发生途径获得的组培苗再生频率低、组培技术体系不稳定等问题本试验在前人研究的基础上，以粉和平月季的组培苗叶片为外植体，重点研究2,4-D、TDZ等植物生长调节剂及暗培养时间对愈伤组织形成、不定芽诱导的影响，以期建立稳定、高效的月季再生体系1 材料与方法1.1 试验材料以粉和平健壮且带有腋芽的中部茎节为外植体，经消毒（去除叶片和茎刺，流水冲洗2 h，用软毛刷轻轻刷洗表面1遍，再用青霉素0.625 g/L和多菌灵1 g/L混合液浸泡10 min、蒸馏水冲洗3次，用吸水纸吸干表面水分，再将其剪成 2～3 cm长的带腋芽茎段在无菌条件下，将带芽茎段置于75%酒精中浸摇1 min，然后用0.1％ HgCl2浸泡8 min，无菌水冲洗6次、每次1 min，并轻轻摇动）后接入MS+6-BA2.0 mg/L+NAA0.01 mg/L的腋芽诱导培养基上，光培养20 d后即可得到生长旺盛的组培苗。

将生长良好的无菌组培苗叶片切下备用每升MS培养基均附加蔗糖30 mg、琼脂5.2 mg，并将pH值调节至5.8，下同1.2 试验方法1.2.1 2,4-D对粉和平叶片愈伤组织诱导的影响 取粉和平的无菌幼嫩叶片为外植体，将其切成0.5平方米大小，叶被朝下接种于愈伤组织诱导培养基MS+2,4-D（0、3、5、7、8、9 mg/L）中，光培养〔25（±）℃，光照强度 2 000 Lx、每天连续光照12 h〕20 d后，统计愈伤组织的诱导率并观察其愈伤质量每个处理3次重复，每个重复15个外植体1.2.2 暗培养时间及TDZ对不定芽诱导的影响 将1.2.1获得的愈伤组织转入不定芽诱导培养基MS+TDZ1.2 mg/L+NAA0.01 mg/L+GA30.1 mg/L中，23（±1）℃暗培养0、8、10、12、14、16 d后，转入光培养25 d，统计不定芽的诱导率及其生长情况每个处理3次重复，每个重复20个外植体将1.2.1获得的粉和平愈伤组织转入含有不同TDZ浓度的不定芽诱导培养基﹝MS+ TDZ（0.5、1.0、1.2、1.5、2.0 mg/L）+NAA0.01 mg/L+GA30.1 mg/L﹞上，暗培养14 d后转入光培养25 d，统计不定芽的诱导率及其生长情况。

每个处理3次重复，每个重复20个外植体不定芽诱导率（%）=诱导出不定芽的愈伤块数/接种的愈伤块数×1001.2.3 粉和平不定芽的壮苗和生根培养 将诱导出的粉和平不定芽（2 cm左右）转入不定芽壮苗培养基MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.01 mg/L中，培养25 d后将2～3 cm长的健壮小苗转入生根培养基MS+IBA（0、0.01、0.1、0.2 mg/L）中光培养，30 d后统计根的诱导率及其生长情况 2 结果与分析2.1 2,4-D对愈伤组织诱导的影响从表1可以看出，在未添加2,4-D的培养基上未能诱导出月季愈伤组织，而在添加了2,4-D的培养基上均能诱导出愈伤组织方差分析表明，在添加不同浓度2,4-D的培养基上，愈伤组织的诱导率和质量均有一定的差别，其中以2,4-D浓度为5 mg/L最利于愈伤组织的诱导，2,4-D浓度为9 mg/L时愈伤诱导率较低、愈伤质量较差试验中发现，外植体培养4 d 后，在叶片切块周围边缘以及维管束周围出现膨大现象，培养7 d后开始出现致密的颗粒状愈伤组织，12 d后愈伤组织生长加快并逐渐连在一起由图1可知，当2,4-D浓度为5 mg/L时，愈伤质量为优（图1a），质地疏松程度适中，呈黄绿色，此种愈伤较易诱导不定芽的产生。

当2,4-D浓度低于5 mg/L时，愈伤组织的质地随着2,4-D浓度的降低逐渐变得较为致密当2,4-D浓度为3 mg/L时，质地疏松程度与“优”相近，颜色稍微深一些（图1b）当2,4-D浓度为1 mg/L时，愈伤诱导率很低且愈伤组织过于致密，不能诱导出不定芽（图1d）当2,4-D浓度为8 mg/L时，出现较大颗粒透明愈伤，颜色发白，容易褐化（图1c）当2,4-D浓度为7 mg/L时，愈伤质量同图1c当2,4-D浓度为9 mg/L时，愈伤质地更为疏松，暗培养条件下极易褐化死亡2.2 暗培养时间对不定芽诱导的影响暗培养时间对不定芽诱导的影响结果见表2由表2可知，愈伤组织转接于不定芽诱导培养基MS+TDZ1.2 mg/L+NAA0.01 mg/L+GA30.1 mg/L中分别暗培养10、12、14、16 d后，各处理的不定芽诱导率在18.33%~30.00%之间，处理间差异不显著，其中以暗培养14 d的处理诱导率最高，可达30.00%而暗培养12 d、14 d、16 d的不定芽诱导率与暗培养0 d、8 d处理间的差异达极显著水平观察结果表明，暗培养0 d的粉和平愈伤组织未能诱导出不定芽；暗培养8～10 d的愈伤组织渐渐发白、疏松，开始陆续诱导出不定芽，但由于暗培养时间较短，转至光培养后仍有很大一部分愈伤不能诱导出不定芽；而暗培养14～16 d的不定芽诱导率较高，其中以暗培养14 d处理诱导出的不定芽生长情况（图2a）最佳，而暗培养时间过长（16 d），愈伤组织容易褐化死亡（图2b）。

2.3 TDZ对不定芽诱导的影响由表3可知，生长良好的愈伤组织在TDZ浓度为1.0、1.2和1.5 mg/L的不定芽诱导培养基上黑暗培养14 d后，其不定芽诱导率在13.33%~20%之间，处理间差异不显著，其中以TDZ浓度为1.2 mg/L处理的诱导率最高、达20%而TDZ浓度过低（0.5 mg/L）或过高（2.0 mg/L）均对不定芽的诱导不利，诱导率分别仅为1.67%、3.33%可见，MS+TDZ1.2 mg/L+NAA0.01 mg/L+GA30.1 mg/L培养基暗培养14 d对粉和平不定芽的分化较为有利观察发现，暗培养5 d后，在TDZ浓度为1.2～1.5 mg/L的培养基上，愈伤组织由黄绿疏松状变成黄白色透明状（图3a）；当TDZ浓度为0.5～1.0 mg/L时，产生透明愈伤组织的外植体数较少，而且在诱导后期愈伤组织的质地变得更加致密，少数变为红褐色（图3b）；暗培养14 d后，贴近培养基处的愈伤组织分化出明显的白色不定芽（图3c），再将其转入光培养后白色不定芽又很快变成绿色（图3d）2.4 不定芽的壮苗和生根培养将诱导出2 cm长的不定芽（图4a）转入不定芽壮苗培养基MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.01 mg/L上，培养25 d左右芽枝叶粗壮，生长力旺盛，芽底部紧贴培养基部分有少量愈伤颗粒产生（图4b）。

将生长健壮的无根小苗转入生根培养基MS+IBA（0、0.01、0.1、0.2 mg/L）中光培养，30 d后统计小苗的生根率发现，在4种培养基上的生根率均较低（分别为0、8%、4%、1%），且根细弱无侧根（图4c），需进一步试验筛选3 结论与讨论3.1 2,4-D对愈伤组织的诱导作用前人的研究表明，生长素能够促进愈伤组织的形成[5]，一般生长素的浓度越高，愈伤组织的颜色越偏于黄白色，质地也越疏松[6]在本试验中，当培养基中未添加2,4-D时，诱导不出愈伤组织，说明2,4-D对于月季叶片愈伤组织的形成是至关重要的当2,4-D浓度在3～9 mg/L范围内时，均能诱导出愈伤组织，且愈伤组织诱导率较高（82.22％～91.11%），但愈伤组织的质量差异很大；随着2,4-D浓度的增大，愈伤组织的质地由致密（愈伤诱导率较低）变为疏松，颜色由褐色变为黄绿色和黄白色，当2,4-D浓度为9 mg/L时愈伤质地过于疏松，颜色变为雪白色，在暗培养条件下极易褐化死亡本试验筛选出诱导月季愈伤组织的最佳培养基为MS+2,4-D 5.0 mg/L3.2 TDZ与不定芽的诱导TDZ对大多数植物的不定芽诱导有促进作用[7]，但不利于芽的伸长和长大，长时间在这种培养基上培养，可使芽畸形或影响芽后期的发育，促进愈伤组织形成而降低植株再生率[8]。

本试验结果表明，培养基中加入TDZ对不定芽的诱导有促进作用，但是当浓度超过1.2 mg/L时不定芽诱导率下降，说明TDZ诱导月季不定芽的形成有一个最适浓度，本试验研究认为1.2 mg/L是最适于月季不定芽诱导的TDZ浓度粉和平叶片愈伤组织在MS+TDZ1.2 mg/L+NAA0.01 mg/L+GA30.1 mg/L的不定芽诱导培养基上诱导不定芽效果最好3.3 暗培养时间与不定芽的诱导牛建新等[9]指出，组织培养过程中暗培养可以促进不定芽的高效再生，这可能是由于IAA在光下的分解减少，从而相对提高了IAA的浓度，进而刺激了不定芽的产生本试验也发现，适当时间的暗培养有助于诱导不定芽形成，最佳暗培养时间为14 d，本试验中诱导发生不定芽的培养基组合中并未添加IAA至于暗培养促进不定芽再生的机理还有待进一步研究3.4 壮苗和生根培养在不定芽壮苗培养基MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.01 mg/L中，待培养25 d左右，芽枝叶粗壮，生长力旺盛，芽底部紧贴培养基部分有少量愈伤颗粒产生 Reference：[1] Rout G R, Samantaray S, Mottlely I Das P. Biotechnology of the Rose a review of recent progress[J].Scientic H orticulture,1999,81(4):201-228.[2] Dohm A, Ludwig C,Nehring K, et al. Somatic embryogenesis in Roses[J]. Acta Horticulture, 2001,547(6):341-348.[3] Li X Q, Krasnyanski S. Somatic embryogenesis secondary Somatic embryogenesis and shoot organogenesis in Rosa[J]. Journal of Plant Physiology, 2002, 159(6):313-319.[4] Kin C K, Chung J D, Jee S, et al. Somatic embryogenesis f。