急性缺血再灌注肾损伤中肾小管上皮细胞的逆向分化及其发生机制.pdf

中山大学硕士学位论文急性缺血再灌注肾损伤中肾小管上皮细胞的逆向分化及其发生 机制姓名：周青松申请学位级别：硕士专业：临床检验诊断学指导教师：姜傥20060601中山大学硕士学位论文急性缺血再灌注肾损伤中肾小管上皮细胞的逆向分化及其发生机制急性缺血再灌注肾损伤中肾小管上皮细胞的逆向分化及其发生机制专业：临床检验诊断学硕士研究生：周青松指导教师：姜傥教授摘要在肾脏发育过程中，胚胎期肾小管上皮细胞是由间充质细胞分化而来在胚胎发育晚期，间充质细胞慢慢失去其作为间充质细胞的表型，并同时逐步获得上皮细胞的形态和功能学特征，完成间充质细胞——上皮细胞( M e s e n c h y m a l —E p i t h e l i u mT r a n s d i f f e r e n t i a t i o n ，M E T ) 的表型转化组织胚胎学理论认为，上皮细胞是成熟的终末功能细胞，一经发育成熟便不能再进一步分化但近年来的研究表明，在某些疾病比如恶性肿瘤、肾脏慢性损伤的发生和发展过程中，存在着细胞的逆向分化现象：上皮细胞在特定的病理状态下，通过上皮细胞一肌成纤维细胞问的逆向转型成为具有多向分化功能的间充质细胞，即卜皮细胞——问充质( E p i t h e l i u m ．M e s e n c h y m a lT r a n s d i f f e r e n t i a t i o n ，E M T ) 的逆向分化。

E M T 现象被认为是组织胚胎学界的一场革命目前发现，E M T 可能涉及细胞的迁徙、损伤修复、疾病的迁延等一系列细胞病理、生理功能因此研究疾病状态下的E M T具有十分重要的意义在恶性肿瘤的发生发展过程中，E M T 现象的出现可能预示着肿瘤细胞出现了两种或两种以上的表型，是肿瘤恶性程度增高的标志此时E M T 的结果可能给临床的诊断和治疗带来新的困难血管内皮细胞发生E M T 后导致细胞功能障碍也是各类血管疾病发生的重要因素E M T 与创伤修复密切相关在神经疾病中，成熟的神经细胞能在一些特定条件的干预下被诱导逆向分化成为干细胞或幼稚急性缺血再灌注肾损伤中肾小管上皮细胞的逆向分化及其发生机制中山大学硕士学位论文细胞，干细胞或幼稚细胞再分化来修复损伤的神经细胞皮肤在创伤或烧伤后的修复过程中，成熟的表皮细胞能在表皮细胞生长因子的作用下向表皮干细胞E M T ，使损伤快速愈合研究发现，E M T 可能与肾小管上皮细胞再生、修复、纤维化等有密切关系慢性肾损伤过程中我们曾发现逆向分化的存在，由肾小管上皮细胞——间充质细胞转化获得间充质细胞标记n —S M A 肾脏急性损伤过程中也涉及再生、修复等一系列病理生理过程，我们推测急性l 肾损伤过程中可能也存在E M T ；肾小管上皮细胞可通过E M T 逆向分化生成具有多向分化功能的间充质细胞，继而分化、参与肾小管的再生。

追溯到肾脏胚胎发育过程中，我们可以发现，E M T 实际上是肾脏发育M E T的一种逆向分化过程，其涉及了一系列参与、影响肾小管上皮细胞发育基因的开启和关闭肾脏发育早期，问充质细胞群与输尿管芽开始接触时，一些基因获得启动调控肾脏的发育，其中研究得较为清楚的基因有W i l m ’S 肿瘤基因( w T l ) 及队x 家族基因p a x 2 有研究提示W T l 、p a x 2 可能互为靶基因W T l 、p a x 2 的表达时间、部位、数量的消涨与肾脏发育过程中间充质细胞——上皮细胞分化存在密切的关系W T l 、p a x 2 在肾脏发育早期便表达升高，随着肾小管上皮细胞的发育成熟，W T l 、p a x 2 表达逐渐下降至消失正常的成年肾近曲小管细胞核内不表达p a x 2 和W T l 胚胎学研究发现，W T l 或p a x 2 基因敲除小鼠的胚胎肾不能发育：W T l 、p a x 2 基因突变均引起肾肿瘤的发生或者肾脏畸形发育我们前期的研究发现：在胚胎成熟后，上皮细胞内控制闽充质细胞表型的基因信息并非完全消失而只是暂时关闭在l 肾胚胎发育时w T l 出现表达，肾脏发育成熟后表达几近消失，w T l 基因呈关闭——开放——关闭的模式。

在慢性肾损伤中w T l 重新一过性开放，其重新开放可能与肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞逆向分化相对于进行性肾间质纤维化导致慢性肾衰，l 临床上急性肾衰病因复杂、病情变化迅速，且个体差异很大，l f 缶床缺乏快速诊断和疗效评价技术，故目前急性肾衰的治疗难以达到满意效果肾前、肾后以及肾性的多种病因均可导致急性肾衰的发生研究发现，在急性肾小管坏死的实验动物和患者的肾脏，大部分I l - 罾d , 管受损伤，随后发生一系列再生、修复事件，包括近曲小管S 2 ／S 3 节段及髓袢降枝粮段( _ 『A L H ) 细胞的再生，残留肾小管上皮细胞的再生、修复，间质纤维母细胞I I中山大学硕士学位论文急性缺血再灌注肾损伤中肾小管上皮细胞的逆向分化及其发生机制的再生等，增殖细胞通过正向分化，修复肾单位的功能完整性，肾脏局部许多因子参与了’肾脏小管的再生过程结合以上研究背景，我们假设：l 肾小管上皮细胞在肾脏急性损伤的情况下，也可能出现逆向分化，转变为具有增殖分化潜能的问充质细胞，在特定的肾脏局部环境诱导下，参与肾小管上皮细胞的再生、修复为此，我们以急性缺血再灌注损伤动物和P T E C ( 肾近曲小管上皮细胞) 体外培养为研究模型，采用放射免疫学、分子生物学及免疫化学等技术，熏点观察肾脏急性损伤后肾小管上皮细胞是否发生E M T ，倘若如此，将进一步深入研究可能涉及E M T 的细胞和分子学发生机制。

此方面的研究国内外尚未见报道我们设计并进行了以下研究：1 ．急性缺血再灌注损伤模型的建立：目的：建立缺血再灌注损伤模型，为观察急性缺血再灌注损伤后的肾脏局部环境变化和肾小管上皮细胞是否存在E M T 现象奠定基础材料和方法：将7 2 只雄性W i s t a r 大鼠( 1 5 0 9 ～2 0 0 9 ) 的两侧肾动脉同时用动脉夹夹闭4 5 分钟后松开，制作肾脏急性缺血再灌注模型按照再灌注的时间不等，将模型大鼠分为0 ，2 4 ，4 8 ，7 2 ，9 6 ，1 2 0 小时六个组，每组设假手术组作为对照宰杀前一天收集2 4 小时尿，宰杀前收集静脉血，分别测尿量、血清尿素氮、肌酐、血清总蛋白和白蛋白结果：急性缺血再灌注模型大鼠2 4 小时肾功能已显著下降，实验组血清尿素氮、肌酐水平明显升高，与对照组相比差异有统计学意义( P 均< O ．0 1 ) 模型组大鼠2 4 小时尿量少，4 8 小时尿量明显增多，之后逐渐恢复正常未见肉眼血尿( 血尿不作为观察标准之一) 肾脏病理见H E 染色见大量小管上皮细胞肿胀、空泡变性部分肾小管上皮细胞刷状缘扁平、管腔扩张，部分肾小管呈片状坏死，部分肾小管上皮细胞可见单个坏死、脱落，肾小管基底膜裸露；部分扩张的肾小管管腔内可见大量的上皮细胞碎片、红细胞管型，肾间质见片状炎性细胞浸润。

提示肾急性缺血再灌注模型建立成功结论：成功建立大鼠肾脏急性缺血再灌注损伤模型，为下一步研究肾脏急性损伤过程中肾小管上皮细胞的逆向分化及其相关机制奠定了良好的基础2 ．急性缺血再灌注损伤模型中肾小管上皮细胞逆向分化的发生：目的：观察肾脏急性缺血再灌注损伤后模型中肾小管上皮细胞E M T 的发生I I I急性缺血再灌注肾损伤中肾小管上皮细胞的逆向分化及其发生机制中山大学硕士学位论文可能，研究E M T 发生的趋势和分布，探讨其与急性肾损伤之间的内在联系及其可能的病理学作用，并为下一步实验做准备材料和方法：通过R T - P C R 和免疫组织化学的方法检测急性缺血再灌注损伤模型中肾小管上皮细胞内肌成纤维细胞标记Ⅱ一S m o o t h M u s c l e A c t i n ( Q ．S M A )的表达及其变化结果：急性缺血再灌注损伤中，发现肾脏皮质肾小管上皮细胞出现明显的a—S M A 的m R N A 表达，其变化趋势呈双相性( 先升高后降低) ，其中7 2 小时为表达峰值组织学观察显示n ．S M A 可表达于病灶内肾近曲小管上皮细胞中结论：肾脏缺血再灌注损伤后，成熟的肾近曲小管上皮细胞胞浆内可检测到间充质细胞标记a —S M A 表达，提示急性损伤后的’肾小管上皮细胞可向间充质细胞逆向分化。

3 ．急性缺血再灌注损伤模型中P E T C ( 肾近曲小管上皮细胞) 逆向分化的发生机制研究：1 ) 胚胎肾小管上皮细胞发育的关键性基因W T l 、p a x 2 的可能作用目的：观察肾脏急性缺血再灌注损伤时，肾小管上皮细胞E M T 与胚胎肾脏发育密切相关的基因W T l 、p a x 2 表达和变化之间的关系探讨’肾脏急性缺血再灌注损伤后、ⅣT l 、p a x 2 基因的重新表达及其变化与肾小管上皮细胞逆向分化之间可能的内在联系材料和方法：通过R T - P C R 、免疫组织化学等方法检测急性缺血再灌注损伤肾脏W T l 、p a x 2 表达及其变化情况结果：急性缺血再灌注损伤模型中，w T l 可在再灌注后4 8 小时表达，表达升高维持到缺血再灌注后7 2 小时，之后不能检测到：与此同时，在缺血再灌注后4 8 小时尚可检测到p a x 2 的表达，7 2 小时p a x 2 表达达到峰值，此后迅速下降，1 2 0 小时p a x 2 表达消失a ．S M A 的表达亦于7 2 小时达到峰值，之后呈缓慢下降趋势W T l 、p a x 2 的表达下降时间先于a —S M A 。

结论：急性缺血再灌注损伤模型中E M T 的发生与胚胎肾脏发育密切相关的基因W T I 、p a x 2 有密切联系，W T l 、p a x 2 呈一过性升高，随之发生Ⅱ．S M A 的双相性升高，且w T l 、p a x 2 的表达下降时间先于q ．S M A 2 ) 肾脏局部R A S 系统的可能作用：中山人学硕士学位论文急性缺血再灌注肾损伤中肾小管上皮细胞的逆向分化及其发生机制①在体研究：局部R A S 系统的变化：目的：观察急性缺血再灌注肾损伤后，模型大鼠体内局部R A S 系统的变化趋势，以此探讨肾脏在急性损伤后局部R A S 的变化对P E T C 逆向分化的可能影响材料和方法：通过放射免疫学的方法，检测急性缺血再灌注损伤过程中肾脏局部R A S 的变化结果：肾脏急性缺血再灌注后，局部R A S 呈现激活趋势，A n g l l 分泌呈明显增高随着再灌注时间延长，A n g I I 水平持续维持高水平状态结论：急性缺血再灌注肾损伤模型中有局部R A S 系统的启动，A n 9 1 I 水平在再灌注损伤初期持续维持高水平状态②体外研究：R A S 系统的激活与P E T C 转型之间的关系目的：体外建立局部不同浓度的R A S 环境，观察P E T C 细胞( N R K - 5 2 E )n —S M A ( 肌成纤维细胞标记) 的表达和变化情况。

此外，尚同时观察A n g I I 受体( A T 2 R ) 阻断后以及涉及A n g1 I 的信号传导通路J A K 2 的阻断对肾小管上皮细胞逆向分化的影响，以深入探讨局部R A S 对E M T 的影响及可能机制材料和方法：将培养细胞随机分为以下各组：空白对照组、A n g I I 刺激组、A n g I I 刺激+ A T 2 R 受体阻断组、A n g I I 刺激+ 信号通路蛋白J A K 2 阻断组四组，除空白对照组外，各组分设1 0 ～m o l ／L ，1 0 9m o l ／L ，1 0 1 1m o l ／L 三个不同浓度和5 、1 0 、1 5 、3 0 、6 0 分钟五个不同时间点，通过R T - P C R 检测A n g I I 作用不同时间和浓度，以及A n g I I 受体阻断及信号传导阻断的不同情况。