老龄化对大鼠黑质致密部多巴胺能神经细胞的影响研究论文.pdf

徐州医学院硕士学位论文论文独创性声明是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究成果其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中作了明确的声明并表示了谢意作者签名：量堕日期：2 Q Q 墨笙≤旦论文使用授权声明本人完全了解徐州医学院有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文保密的论文在解密后遵守此规已j ^ 匕作者签名：堕堡导师签作者签名：博_ 氏．导师签日期：至Q Q 墨生笸旦徐州医学院硕士学位论文论文审阅认定书研究生苴绘在规定的学习年限内，按照研究生培养方案的要求，完成了研究生课程的学习，成绩合格；在我的指导下完成本学位论文，经审阅，论文中的观点、数据、表述和结构为我所认同，论文撰写格式符合学校的相关规定，同意将本论文作为学位申请论文送专家评审导师签名：5 7日期：2 Q Q 墨生刍徐州医学院硕士学位论文老龄化对大鼠黑质致密部D A 能神经细胞的影响研究中文摘要目的探讨老龄化对大鼠黑质致密部( s u b s t a n t i an i g r ap a r sc o m p a c t a ，S N c ) 多巴胺( d o p a m i n e ，D A ) 能神经细胞退行性变的作用机制。

方法健康S D 大鼠根据月龄分为成年组( 4 - 5 月龄，体重2 2 0 - 2 5 0g ) 和老年组( ／> 2 4 月龄，体重5 5 0 —6 0 0g ) ，一部分取左侧中脑黑质组织匀浆，行酪氨酸羟化酶( t y r o s i n eh y d r o x y l a s e ，T H ) 、钙结合蛋白( c a l b i n d i n - D 2 8 k ，C B ) m R N A 和蛋白表达的检测，用I m a g e J 软件分析处理另一部分根据大鼠脑图谱将左侧黑质致密部分为嘴侧、中间侧、尾侧段做连续冠状石蜡切片，结合免疫组织化学染色方法，观察两组黑质致密部T H 和C B 的阳性细胞表达情况，并行细胞计数，统计学分析；其余的进行T H 的免疫电镜观察D A 神经细胞的超微结构变化结果( 1 ) 与成年组比较老年组黑质致密部D A 能神经细胞T H m R N A 转录水平降低和尾侧段T H 阳性神经细胞减少，差别有统计学意义6 0 O ．0 5 ) ．M e a n w h i l et h em e t a b o l i s mf u n c t i o no fD An e u r o n sw a sf a i l e do nt h el e v e lo fu l t r a s t r u c t u r e ．( 2 ) A sc o m p a r i n gt ot h ea d u l tg r o u p ，t h el e v e lo fC B m R Na n dC Bp r o t e i ni nS Nw e r en o ts i g n i f i c a n tc h a n g e d ( 矿0 ．0 5 ) ．M e a n w h i l et h et o t a ln u m b e ro fC Bp o s i t i v en e u r o n si nS N cw e r en o ts i g n i f i c a n tc h a n g e d ( 矿0 ．0 5 ) ．B u tt h en u m b e ro fC Bp o s i t i v en e u r o n si nt h ec a u d a lo fS N cw e r es i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e di na g e dg r o u pp ／2 4 月龄，体重5 5 0 - 6 0 0g ) ，每组各2 0 只。

以上动物均由徐州医学院实验动物中心提供，给予自由饮食饮水，白天1 2h 活动，黑夜1 2h 睡眠保持室温( 2 3 士2 ) ℃，相对湿度( 6 0 - 士5 ) ％1 ．2 主要试剂小鼠抗大鼠T H 单克隆抗体( 一抗)S i g m a 公司小鼠抗大鼠C B 单克隆抗体( 一抗)S i g m a 公司生物素结合的羊抗小鼠抗体( - - 抗)S i g m a 公司辣根过氧化物酶标记的生物素卵白素复合物S i g m a 公司牛血清白蛋白S i g m a 公司p r o t e i nA ／G —s e p h a r o s eS i g m a 公司碱性磷酸酶结合的羊抗鼠、羊抗兔抗体和兔抗羊抗体( I g G ·A P ，二抗)S i g m a 公司硝酸纤维过滤膜( n i t r o c e l l u l o s e f i l t e rm e m b r a n e ，N C ) S i g m aB i o t e c h n o l o g y 公司5 一溴一4 一氯一3 一吲哚磷酸( B C I P ) 和氮蓝四唑( N B T ) P r o m e g a 公司封闭用血清原液北京中山生物工程有限公司D A B北京中山生物工程有限公司T r i z o l 和逆转录酶均购于北京鼎国生物技术有限公司D E P C ，5 x R T 缓冲液，随机引物，d N T P ，琼脂糖，D N A 分子质量标准D N AM a r k e r及2 x T a qP C RM a s t e r M i x ( 含有T a qD N A 聚合酶、d N T P s 、M g C l 2 、反应缓冲液、P C R 反应的增强剂和优化剂及稳定剂)均购于南京依贝仪器设备有限责任公司8徐州医学院硕士学位论文T H 分子引物序列【1 5 】：上游引物5 ．C C CC A CC T GG A GT A TT T TG T G 一3 ，下游引物5 一A T CA C GG G CG G AC A GT A GA C C - 3 ，P C R 扩增后产生5 1 9 b p 的c D N A 片段C B 分子引物序列【1 6 】：上游引物5 ．G A TG C CA G C A A CT G AA G T ．3 ，下游引物5 一G G CC T AA G CA T AG A CT T T 一3 ，P C R 扩增后产生7 3 2 b p 的c D N A 片段1 3 ．a c t i n 分子引物序列：上游引物5 ．G A CA A GC C CA C CA A CT G CA C C ．3 ，下游引物5 一C G TC C CC T GA A GA A CA A GA G C 一3 ，P C R 扩增后产生2 1 7 b p的c D N A 片段上述引物均由上海生工生物工程公司合成其他试剂均为国产分析纯或化学纯。

1 ．3 试剂配制O ．1MP B ( 0 ．1M 磷酸盐缓冲液[ p h o s p h a t eb u f f e r , P B ] ，p H 7 ．4 2 )N a 2 n P 0 4 ( 磷酸氢二钠)2 8 ．7 0gN a H 2 P 0 4 ( 磷酸二氢钠)2 ．9 6gd d H 2 0 ( 双蒸水) t o ( 加至)1 0 0 0m l0 ．0 1MP B S ( O ．0 1M 磷酸盐生理盐水缓冲液[ p h o s p h a t eb u f f e rs a l i n e ，P B S ] ，p H 7 ．3 4 )N a 2 H P 0 43 ．7 5gN a H 2 P 0 4N a C I ( 氯化钠)d d H 2 0O ．9 ％N a C l ( 0 ．9 ％生理盐水)N a C ld d H 2 04 ％多聚甲醛多聚甲醛0 ．1 MP Bt o90 ．4 3g7 ．2 0g1 0 0 0m l9 ．0 0g1 0 0 0m l4 0g5 0 0m l徐州医学院硕士学位论文在通风柜内加热使之解聚、溶解，待冷却后过滤0 ．1 MP Bt o1 0 0 0m lD A B 显色试剂( 现用现配)A 液B 液A 液B 液C 液滴入1m ld d H 2 0 中N a 2 H P 0 4d d H 2 0N a H 2 P 0 4d d H 2 00 ．2MP B ( 0 ．2M 磷酸盐缓冲液，p H 7 ．4 )A 液B 液混匀备用2 ．5 ％戊二醛2 5 ％戊二醛0 ．2MP B ( p H 7 ．4 1d d H 2 01 ％锇酸0 ．2MP B ( p H 7 ．4 1d d H 2 02 ％锇酸溶液1 01 谪1 滴1 滴2 8 ．4g1 0 0 0m l2 4 ．0g1 0 0 0m l8 1m l1 9m l5m l2 5m l2 0m l3m l3m l6m l徐州医学院硕士学位论文铬矾明胶溶液明胶d d H 2 0水浴溶化。

铬矾( 硫酸铬钾)d d H 2 0t o溶解后过滤5 ．0 0g5 0m l0 ．5 0 - 5 ．0 0g1 0 0 0m lH o m o g e n i z a t i o nb u f f e r ( 匀浆液)5 0m MH E P E S ( p H7 ．4 ) ，15 0m MN a C l ，12m M1 3 - g l y c e r o p h o s p h a t e ，3m Md i t h i o t h e i t o l ( D T T ) ，2m Ms o d i u mo r t h o v a n a d a t e ，1m ME G T A ，1m MN a F ，1m Mp h e n y l m e t h y l s u l f o n y lf l u o r i d e ( P M S F ) ，1 ％T r i t o nX - 10 0 ，5l x g ／m lo fl e u p e p t i n ，p e p s t a i nAa n da p r o t i n i n ．电解液2 5m m o l ／1T r i s ( p H8 ．3 ) ，2 5 0m m o l ／1g l y c i n ，0 ．1 ％S D S ．电转液2 5m m o l ／1T r i s ( p H 8 ．3 ) ，19 2m m o l ／lg l y c i n ，2 0 ％( V ／V ) m e t h y la l c o h o l ，0 ．0 5 ％S D S ．B u f f e rAp H 7 ．910m m o l ／1H e p e s ，10m m o l ／lK C l ，0 ．5m MM g C l 2 ，0 ．1r n l V lE D T A ，1m m o l ／1d i t h i o t h e i t o l ( D T T ) ，5 0m m o l ／LN a F ，10m m o l ／1p 一磷酸甘油，1m Ms o d i u mo r t h o v a n a d a t e ，L e u p e p t i n 、p e p s t a t i nA 、A p r o t i n i n 各10r t g ／m l ，O ．5m m o l ／lP h e n y l m e t h y l s u l f o n y lf l u o r i d e ( P M S F ) ，lm MP N P PB u f f e rBp H 7 ．92 0m m o l ／1H e p e s ，0 ．4m m o l ／1N a C I ，0 ．5m MM g C l 2 ，1m m o l ／1E D T A ，1m m o l ／lE G T A ，1m m o l ／1D。