抗坏血酸含量测定(分光光度计法).pdf

植物生理学模块实验指导植物生理学模块实验指导李玲 主编科学出版社一、一、维生素维生素 C C 含量的测定方法（分光光度计法）含量的测定方法（分光光度计法）【实验目的】学习利用分光光度计法测定维生素 C（抗坏血酸）含量的原理和方法实验原理】维生素 C（抗坏血酸）具有较强的还原力，可以把铁离子（Fe3+）还原成亚铁离子（Fe2+），亚铁离子与红菲啰啉（4,7-二苯基-1,10-菲啰啉，BP）反应形成红色螯合物此化合物在波长 534nm 处具有强的吸收峰，且吸光度与反应液中抗坏血酸含量呈正相关因此，可用比色法来测定抗坏血酸含量器材与试剂】1. 实验仪器与用具离心机、分光光度计、研钵、电子天平、容量瓶（50ml 和 100ml）、漏斗、滤纸、离心管、试管2. 实验试剂50g/L 三氯乙酸（TCA）溶液：称取 5g 三氯乙酸（分析纯），用蒸馏水溶解，稀释至100ml磷酸-乙醇溶液：量取 85%磷酸溶液加入到无水乙醇中，并用无水乙醇稀释至 100ml5g/L BP-乙醇溶液：称取 BP（纯度>97%）加入到无水乙醇中溶解，并用无水乙醇稀释至50mlL FeCl3-乙醇溶液：称取 FeCl3加入到 100ml 无水乙醇中，摇匀。

100μg/ml 标准抗坏血酸溶液：称取 10mg 抗坏血酸（应为洁白色，如变为黄色则不能用），用 50g/L TCA 溶液溶解，定容至 100ml，即 1ml 溶液含 100μg 抗坏血酸现用现配，保存于棕色瓶中，低温冷藏3. 实验材料苹果、梨、香蕉、柑橘等果实实验步骤】1. 制作标准曲线取 7 支试管，编号，按表 1 加入各种溶液，将混合液置于 30℃反应 60min，然后以 0 号试管混合液为参照，于波长 534nm 处测定吸光度值以抗坏血酸质量为横坐标，吸光度为纵坐标汇至标准曲线，求的回归方程表表 1 1制作抗坏血酸标准曲线试剂含量制作抗坏血酸标准曲线试剂含量项目0抗坏血酸标准液/ml012混匀、摇匀%磷酸-乙醇溶液/ml5g/L BP-乙醇溶液/mlL FeCl3-乙醇溶液/ml相当于抗坏血酸量/μg0102030405060试管号345650g/L TCA/ml无水乙醇/ml2. 提取洗净新鲜果实，吸干，剪碎后混匀，分别称取5g 样品置于研钵中，加入20ml 50g/LTCA 溶液，在冰浴条件下研磨成浆状，转入到 100ml 容量瓶中，并用 50g/L TCA 溶液定容至刻度，混合、提取 10min 后，过滤收集滤液备用。

3. 测定取 1ml 样品提取液于试管中，加入 1ml 50g/L TCA 溶液，再按制作标准曲线想通的方法，加入其他成分，进行反应、测定记录反应体系在波长 534nm 处吸光度重复 3 次实验作业】计算不同果实维生素 C 含量根据吸光度值，在标准曲线上查出响应的混合液中抗坏血酸质量，按下式计算植物组织中抗坏血酸含量植物组织中抗坏血酸含量以 100g 样品（鲜重）中含有的抗坏血酸的质量表示，即 mg/100gV×m抗坏血酸含量=×100 （mg/100g）Vs×M×1000式中，m 为由标准曲线求得的抗坏血酸的质量（μg）；Vs 为滴定时所用样品中提取液体积（ml）；V 为样品提取液总体积（ml）；M 为样品质量（g）实验扩展】利用此法还可以测定植物组织中脱氢抗坏血酸和总抗坏血酸的含量测定原理：利用二流苏糖醇（DTT）将脱氢抗坏血酸还原成还原型的抗坏血酸，这样可以通过测定抗坏血酸的含量对脱氢抗坏血酸进行定量分析测定方法：取 1 ml 样品中提取液，加入 60mmol/L DTT—乙酸溶液，再用 Na2HPO4-NaOH溶液调 p-H 至 7~8，置于室温下 10min，使脱氢抗坏血酸还原。

然后加入 ml 三氯乙酸溶液，调节平 H 至 1~2.按测定抗坏血酸相同的方法进行测定，计算出总抗坏血酸含量，从中减去样品中原有的还原型抗坏血酸含量，即得脱氢抗坏血酸含量。