biorad电泳仪及sds-page凝胶电泳操作规范.doc

使用 BIO-RAD 电泳仪进行 SDS-PAGE 凝胶电泳的操作规范实验原理根据蛋白分子量亚基的不同而分离蛋白，在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移速率主要取决于亚基分子量的大小实验所用仪器FR-200A 全自动紫外与可见分析装置 上海复日科技有限公司电泳仪 BIO-RAD 公司TS-1 型脱色摇床 江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司实验用试剂低分子量蛋白 Maker TAKARA4*上样缓冲 TAKARAPagn Blue protein staining solution Fermentas试剂的配制1. 贮液的配制（1） 凝胶储液取 30g 丙烯酰胺+0.8g 甲叉双丙烯酰胺 0.8g ,先用 35ml 双蒸水溶解，搅拌，直到溶液变成透明，再用双蒸水稀释至 100ml，过滤棕色瓶 4℃保存一个月2）1 mol/l Tris-HCL (PH 8.8)12.1g Tris(三羟甲基氨基甲烷)溶解在 80ml 双蒸水中，用 4mol/l 盐酸调 PH 至 8.8再用双蒸水稀释至 100ml，保存在 4℃冰箱3）1.0 mol/l Tris-HCL (PH 6.8)6.06g Tris 溶解在 40ml 双蒸水中，用用 4mol/l 盐酸调 PH 至 6.8。

再用双蒸水稀释至50ml，保存在 4℃冰箱4）10%过硫酸铵（APS）0.1g 过硫酸铵+1ml 双蒸水使用前新鲜配制（5）Tris–甘氨酸电泳缓冲液的配制（25mmol/L Tris；250mmol/L 甘氨酸(pH8.3)）30.3gTris+ 144.2g 甘氨酸+ 10gSDS，双蒸水定容至 1L 每次使用时 10 倍稀释6） 样品缓冲液使用 4*SDS-PAGE loading buffer(Takara 公司)，上样缓冲与样品比例 1:3 混匀，之后煮沸 5min 2. 凝胶的配制溶液成分 分离胶 12.5%10ml浓缩胶 4%5mlH2O 2.05 3.51凝胶储液 4.15 0.8351.0mol/l Tris-Hcl(PH8.8) 3.75 ---1.0mol/l Tris-Hcl(PH6.8) --- 0.62510%SDS 溶液 0.08 0.0610%过硫酸铵 0.1 0.1TEMED 0.01 0.006注：上表所标体积为配制两块胶的用量若配制一块或多块，可按比例减半或加倍具体步骤如下：1、样品制备：40 µL 蛋白+5* 上样缓冲液 10 µL，煮沸 5 min，冷却后放冰箱下层保存，备用2、制胶1） 用专用的医用棉口罩将胶板擦拭干净，电泳槽清洗干净，组装模具。

注：必须使用专用的棉口罩擦拭胶板，且轻轻的向一个方向擦拭，以免划坏胶板胶板和电泳槽未清洗干净，会影响电泳效果2） 按上表成分配制分离胶，迅速摇匀，沿胶的一边，迅速灌入分离胶，注意勿打入气泡，迅速水封3） 放置 1.5h4） 倾去蒸馏水，用滤纸将未倒干净的水吸干5） 按上表成分配制浓缩胶，迅速摇匀，沿胶的一边，迅速灌入浓缩胶，注意勿打入气泡，迅速插入齿梳6） 放置 1h注：新配置的凝胶，室温放置 5h，使胶充分凝聚、混匀，之后再使用，效果更好忌马上电泳3、配制电泳缓冲及上样取配好的 10*电泳缓冲 130ml，用蒸馏水稀释至 1300ml将制好的凝胶用电泳夹固定至电泳槽中注：短板朝里若只跑一块胶，电泳夹的对面也必须放置一块电泳板倒入电泳缓冲液，液面至短板和长板之间每孔上样量最大 20ul蛋白 Maker 上样量 7ul4、 电泳80V 45min;120V 45min注：若 120v 45min 后，溴酚蓝指示剂前沿距离电泳板下端太远，可延长电泳时间，或适当增加电压，待跑至距电泳板下端 1cm 时停止电泳5、 剥胶剥胶过程必须浸在蒸馏水中进行6、 水洗电泳结束后，用蒸馏水洗胶三次，每次 10min。

7、 染色将胶至于脱色摇床上，使用考马斯亮蓝染色液（fermentas 公司）过夜染色注：考马斯亮蓝染色液的使用，请严格按照染色液说明上的操作步骤进行考马斯亮蓝染液可重复利用 3 次，使用一次的染液请倒回使用一次的回收瓶中，使用过两次的染色液倒回使用两次的回收瓶中，用满三次才可废弃8、 水洗蒸馏水洗 1-2 小时，洗去背景色9、 清洗胶板和电泳槽注：清洗和擦拭胶板时，请使用专用的医用棉口罩清洗，用水冲洗时，轻轻擦拭，将残留的胶清洗干净，注意不要太用力，以免划坏胶板洗好后，放置专用的胶架上晾干，晾干后放入相应的胶盒中10、 清理实验台，将实验仪器摆放整齐组装模具制胶1 2 . 5 % 分离胶 ：凝胶储液 : 4 . 1 5 m l蒸馏水 : 2 . 0 5 m lp H 8 . 8 ( 1 m o l / l ) T r i s - H C l : 3 . 7 5 m l1 0 % S D S : 8 0 µ LT E M E D : 1 5 µ LA P S : 1 0 0 µ L ( 最后加 )水膜封闭空气 （ 凝胶 1 个半小时 ）4 % 浓缩胶 ：凝胶储液 : 0 . 8 3 5 m l蒸馏水 : 3 . 5 1 m lp H 6 . 8 ( 1 m o l / l ) T r i s - H C l : 0 . 6 2 5 m l1 0 % S D S : 5 0 µ LT E M E D : 5 µ LA P S : 6 0 µ L ( 最后加 )插入齿梳 ， 确保无气泡 ， 等 6 0 m i n 左右小心拔出梳子 ， 卸下封条 ， 将玻璃板颠倒放置 ，使短的一端的玻璃板朝内 ， 固定在电泳架上将电泳架放入电泳槽 ， 倒入电泳缓冲液 ， 内槽液面应在前后玻璃板间点样 （ 5 0 µ L 蛋白 + 6 * 上样缓冲液 1 0 µ L ， 煮沸5 m i n ）， 点 5 µ L点 M a r k e r ， 7 µ L调电压至 1 0 0 V ， 电泳约 1 h调电压至 1 2 0 V ， 电泳约 4 5 m i n ， 停止电泳剥胶 ， 固定液浸泡 3 0 m i n染色 ， 6 0 oC ， 1 5 m i n脱色 ， 摇床上摇晃 ， 换脱色液 3 - 4 次拍照请大家务必保证电泳仪器的正确使用，及电泳槽盒电泳板的干净、清洁，为大家创造一个好的实验环境~~。